药用植物分子遗传学(精)

第1章 绪论 药用植物是一类具有药物属性的植物，它和粮食作物一样在人类文明和社会的发展过程中起着极其重要的作用，是人类生存和健康管理的重要保障。人类对药用植物药效的发现是一个从宏观到微观的过程，古生物学研究显示在约6万年前的史前人类尼安德特人的坟墓里保存有药用植物麻黄Ephedra altissima和黄矢车菊Centaurea solstitialis的化石，这表明尼安德特人在寻找植物源食物的过程中，发现部分植物可以用于驱赶蚊虫、治疗疾病等，从而学会了应用药用植物管理他们的健康。在中国、古印度、古埃及和古罗马等文明古国的早期文字中也有大量药用植物从形态到使用的记载，这表明药用植物在古代东西方各国已经成为人类治疗和预防疾病的有效手段。 随着现代科学技术的发展与完善（特别是药用植物分类鉴定、活性成分分离提取、结构鉴定、药效学评价等技术），药用植物的药效物质基础开始逐渐被人们认识。药用植物中天然产物的单体化合物的分离及结构鉴定是19～20世纪的植物化学研究的突出成果，科学家们借助于现代的色谱、光谱、质谱以及核磁等技术，从药用植物中分离、纯化和鉴定出了如青蒿素、紫杉醇、奎宁、吗啡、大麻二酚等单体天然产物成分，用于治疗疟疾、癌症、疼痛等疾病（图1-1）。1897年，拜耳公司首次将柳树皮中的水杨酸合成为酰基水杨酸（阿司匹林），用于治疗头痛与发热、血小板聚集，减少动脉粥样硬化患者的心肌梗死等疾病，这一经典天然产物药物一直沿用到现在并不断焕发新的活力。据统计，现今30%～50%的化学药物都是来自于天然产物、植物药或半合成天然产物及其衍生物。天然产物结构的新颖性和多样性为药物研发提供了大量的候选。但目前部分药企已经放弃了筛选植物源小分子化合物用于治疗各种疾病的项目，主要原因之一是无法获得足量的天然化合物用于后续的开发与应用。越来越多的合成生物学和基因工程的研究案例表明，在应用分子遗传学的方法成功解析药用植物有效成分生物合成途径的基础上，使用生物技术方法大量生产这些有效成分或通过组织培养方式配合基因工程大量繁殖药用植物及其有效部位，将极大地促进药用植物天然产物的开发与利用。 在全球范围内除了药用植物天然产物单体化合物及有效组分外，以药用植物提取物和药材作为原料的药物制剂如传统草药、中成药、汉方药等不同形式的药用植物产品在治疗或预防疾病方面也起到了不可或缺的关键性作用。由于传统草药具有治疗疾病的独*疗效优势，据统计，目前全球约85%的人口特别是发展中国家仍然在应用传统草药治疗疾病，因此充足的药用植物资源是保障民众身体健康的前提。由于药用植物的种类繁多且用药部位多样，导致了不同种类的药用植物的人工选育水平和种植规模差距很大。依据现阶段药用植物原料来源情况，可以将其主要分为以下三大类：①已经具有一些代表性的商业化品种以及成熟的种植技术和大面积的人工种植品种如罂粟、长春花、大麻、人参、西洋参、枸杞等。②虽然已经实现大面积种植，但种质大多直接来自于野生种群的营养体或杂交后代，尚缺乏一致性及稳定性等系统选育的品种如甘草、大黄、重楼等。③主要依赖于野生群体的药用植物如红景天、升麻、七叶树等。针对药用植物品种选育中存在的各种问题，应用药用植物遗传原理解析药用植物有效性背后的分子遗传机制，根据每一种药用植物各自的驯化程度充分选育药用植物使其成为优质的品种用于实际生产。 图1-1 代表性药用植物次生代谢物及代谢途径分类 本书是以药用植物作为研究对象，聚焦药用植物资源开发利用领域的焦点问题；关注应用遗传学研究体系，特别是从分子遗传层面，结合当前遗传学、组学、系统生物学的理论和技术，探讨解决药用植物资源可持续利用实践过程中的关键问题；以期与读者共同推动我国药用植物的分子遗传学研究。本书囊括了药用植物正向遗传学以及反向遗传学的方法，以理论体系、研究手段和经典案例为展现模式，描述药用植物的生物学特征，揭示药用植物有效成分的遗传规律，寻找基因型与表现型之间的关系。 1.1 药用植物分子遗传学的形成和发展过程 植物遗传学经历了孟德尔遗传学和植物分子遗传学两个重要的发展阶段。奥地利的生物学家格雷戈尔 孟德尔（Gregor Mendel，1822～1884年）是遗传学的奠基人，被誉为遗传学之父。他通过豌豆杂交试验发现了遗传学两大基本定律即分离定律和自由组合定律。虽然当时孟德尔并不确定遗传物质的分子基础和基因等概念，但已发现植物体内遗传物质可有规律地影响后代的表型特征，这是现今植物遗传学研究的理论依据和实践指导。在药用植物关键性状的遗传规律研究过程中，孟德尔遗传以及基于孟德尔遗传的衍生理论都起到了至关重要的作用，对部分易杂交的一年生药用植物如黄花蒿、大麻等都有大量的相关研究。20世纪初期，遗传学家摩尔根通过果蝇的遗传实验，认识到基因存在于染色体上，并在染色体上呈线性排列，从而得出染色体是基因载体的结论。1909年丹麦遗传学家约翰逊（W.Johansen 1859～1927年）在《精密遗传学原理》一书中正式提出“基因”概念。其研究发现基因有两个特点，一是能忠实地复制自己，以保持生物的基本特征；二是在繁衍后代过程中基因能够突变和变异。植物分子遗传学从20世纪中期开始迅速发展，这一学科的代表人物是植物遗传学家芭芭拉 麦克林托克（Barbara McClintock）。40年代初期，她用传统的遗传学和细胞学研究的手段发现了玉米叶片以及种子中一些斑点的形成机制，得出了“转座子”的概念，即基因能够“转座”和“跳动”。这一研究结果改变了传统认为基因在染色体上是固定不变的观念。1953年沃森和克里克发现了DNA分子的双螺旋结构，使得人类对生命体有了更进一步的认识，即生命体的基因组包含了其全部遗传信息，这些信息由A-T、C-G四种碱基两两配对后排列成的长链DNA分子携带。随后DNA的复制、表达和突变成为分子遗传学形成的基础。一些革命性的技术如DNA测序技术、聚合酶链反应等则推动着分子遗传学的发展。 药用植物分子遗传学是研究药用植物遗传和变异规律的综合性学科。该学科主要研究药用植物性状（有效成分含量、产量、抗性等）和基因型的关系，从分子水平上研究药用植物基因的结构与功能，遗传与变异，从而揭示药用植物在生长发育和环境应答过程中遗传信息传递、表达和调控的分子机制。药用植物分子遗传学与粮食及园艺作物的分子遗传学研究重点不同，除了抗病、抗逆、高产等基本农艺性状外，药用植物还对有效成分含量这一特殊的性状进行重点研究。同时，由于药用植物的地理分布、驯化以及栽培历史的不同，药用植物主要特征如药用活性成分（次生代谢物）的形成、调控机制往往复杂多样。药用植物分子遗传学研究起步相对较晚，其研究发展过程并未完全遵从经典和现代分子遗传学发展的轨迹。随着组学技术的快速发展，目前大部分药用植物的遗传学研究已经跨过经典遗传学直接进入到了分子遗传学研究的层面。 值得注意的是一些长期致力于药用植物分子遗传学研究的著名学者都提出了相应的学科概念及研究思路。2010年陈士林研究团队首先提出了本草基因组学的学科概念，编写的《本草基因组学》一书由科学出版社出版，该书被纳入普通高等教育“十三五”规划教材及全国高等医药院校规划教材，并在《科学》（Science）专刊发表“Herbalgenomics：Examining the biology oftraditional medicines”一文。本草基因组学（herbgenomics）是从组学水平研究中药及其与人体的相互作用，进而阐明中药防治人类疾病分子机制的一门前沿学科。研究内容涉及结构基因组、转录组、功能基因组、蛋白质组、代谢组、表观基因组、宏基因组、药用模式生物、基因组辅助分子育种、中药合成生物学、DNA鉴定、中药体内代谢基因组研究和生物信息学及数据库等多个方面。本草基因组学作为新兴学科，主要研究内容包括系统发掘中药活性成分合成及优良农艺性状相关基因，为中药道地品种改良和基因资源保护奠定基础；建立含有重要活性成分的中药原物种基因组研究体系，为中药药性研究提供理论基础，对传统药物学理论研究和应用具有重要意义；从基因组层面阐释中药道地性的分子基础，推动中药创新药物研发，为次生代谢物的生物合成和代谢工程提供技术支撑；创新天然药物研发方式，为优质高产药用植物品种选育奠定坚实基础，推动中药农业的科学发展，对揭示药用植物生物学本质具有重要价值。2011年由美国国立卫生院支持的由乔 查普尔（JoeChappell）教授领衔的Medicinal Plant Consortium项目组提出了药用植物多组学计划，该项目通过解析中药药用植物颠茄、红豆杉、银杏等14个物种的代谢组和转录组学数据及部分其他物种的基因组学数据联合挖掘相关代谢产物的合成机制。2013年日本的KazukiSaito教授团队在CurrentOpinion in Plant Biology杂志提出了植物化学基因组学（phytochemical genomics）概念，该学科主要关注在基因组学背景下运用多组学联合分析解析植物代谢物产生的分子机制。在药用植物学领域，该团队以甘草作为研究对象运用多组学联合分析的手段成功地解析了乌拉尔甘草的基因组，同时挖掘到了三萜类物质甘草次酸合成过程中的两个关键步骤所涉及的P450酶的功能。另外越来越多的来自欧洲、亚洲的实验室在药用植物分子遗传学领域做出了卓有成效的工作。 由此可见，药用植物分子遗传学既囊括了传统植物分子遗传学的研究内容，同时也针对药用植物的特殊性，以研究药效成分形成、分布、积累、转运、代谢、多样性等直接决定药用植物成药的遗传机理作为核心任务；该学科既借鉴了传统模式植物、粮食作物等较为成熟的分子遗传学研究体系，又针对药用植物物种层面的多样性，对每种药用植物遗传规律和成药的遗传机理进行个性化研究；既关注植物生长、发育和繁育宏观表型，又侧重药效成分等分子层面微观表型；既强调植物自身的遗传规律的揭示，又不排斥使用现代遗传学技术对药效成分进行定向富集乃至体外生产制备。总之，药用植物分子遗传学，无论从重要性或是研究的维度，都值得单独作为分子遗传学的一个分支进行探讨，这也是本书的一个目标。 1.2 药用植物分子遗传学的研究重点 由于药用植物各自地理分布、驯化栽培历史程度的不同，药用植物主要特征如药用活性成分（次生代谢物）的形成、调控机制往往复杂多样。药用植物分子遗传学与粮食及园艺作物的分子遗传学研究重点不同，除了抗病、抗逆、高产等基本农艺性状外，该学科还对药用植物的有效成分含量这一特殊的性状进行重点研究。现阶段药用植物分子遗传学有以下研究重点，分别为：①研究药用植物个体和群体的遗传和变异规律。②研究药用植物药效物质的形成、调控及进化。③研究药用植物体内外因子对药用植物关键性状形成的分子遗传调控机制。④药用植物分子遗传工程与分子辅助育种。 1.2.1 药用植物个体和群体的遗传和变异规律 遗传多样性是生物表型和进化多样性的基石。药用植物个体或群体间存在的广泛遗传差异导致了不同个体间、居群间样本形态、代谢产物和适应性的差异，从而影响其生产和应用过程。同其他植物一样，生态或地理隔离是药用植物群体产生遗传分化的主要外因，遗传漂变、突变以及由于自然或人为原因导致的遗传混杂等内在因素也会直接造成药用植物个体的遗传差异。比如我国北方地区黄花蒿Artemisia annua的青蒿素含量约0.1%，导致没有工业提取价值，而重庆地区的黄花蒿群体青蒿素含量高到达约0.6%，药用价值明显较高。再如同处于云南文山的三七Panax notoginseng个体表型差异十分明显，茎和根的颜色有绿色和紫色之分，休眠芽的颜色有红绿之别；花序有伞形和复伞形花序；而叶片则分一轮生、二轮生和三轮生掌状复叶，包括卵形、狭叶披针形、倒卵状椭圆形等多样化的小叶；果实有肾形、近球形、三棱形等不同的形状以及朱红色、紫红色、黄白色等不同的颜色；不同形态的三七*终可以发展为不同经济价值的品种。不同紫苏Perill