《生物化学技术原理及应用》要点解析

**章生命大分子物质的制备 　　本章立意，主要是从深刻认识和理解自然界生物，如动物、植物与微生物等的多样性与复杂性出发，进而从构成这些生物的蛋白质（包括酶）、核酸、糖类、激素等大分子物质普遍性和特殊性考虑，*后了解并制定出从诸多生物材料中制备生命/生物大分子物质的概述和策略。 　　生命大分子物质的普遍性是：结构复杂、分子质量大；制备过程（离体后）稳定性较差；有些物质，如酶含量较低；欲制备的生命大分子物质（即有效成分）常与其他物质（即杂质）盘根错节组成不易分离的有机整体等。而这些生命大分子物质的特殊性是：结构、组成与含量变化多端，如同种不同属不一样，同种不同部位有差异，同种同一部位不同生长期有区别，同种生长于不同环境（地域）不一致等，从而导致制备方法的通用性较差。 　　制备（或称提取、纯化，也有人称下游工程）生命大分子物质的概述和策略是：起步时一定要认真分析所用生物原材料的特点、欲制备生命大分子物质的性质和结构，冷静权衡利弊，深人理解、比较可采用的各种分离方法的原理和用途。本着先采取粗放、快速、有利于缩小样品体积和简化后工序的手段，后使用精确、费时和需要样品量少的方法的原则，经过反复试验、修改、评价，才能逐步合理、巧妙地建立一种由数个方法构成的既好又快制备生命大分子物质的有效方案。 　　为了让读者，特别是年轻学生有章可循，我们归纳出以下制备生命大分子物质的关键操作步骤：材料的选择与处理；测定方法的建立；有效成分的抽提；粗制品的纯化和纯品的鉴定。照此办理，定可取得预期结果。本章要点：①建立专一、快速和灵敏的测定方法。②影响抽提有效成分的八大因子。③根据有效成分和杂质理化性质的差异性，设计适当纯化方案并对其进行评价。 　　【典型例题】 　　1.多项选择题 　　胰岛素含量的测定方法有（），较精确的方法是（）。 　　A.光谱法（紫外分光光度法） 　　B.电化学法 　　C.免疫分析法 　　D.生物活性法 　　知识概略 　　（1）光谱法。光谱法测定蛋白质含量的原理是：因大部分蛋白质均含有带芳香环的酪氨酸、色氨酸，而酪氨酸和色氨酸在280nm附近有*大吸收值。因此，大多数蛋白质在此光波附近显示强吸收性能，其值大小可用吸光值（A280）表示。利用这个性质，可定性、定量测定蛋白质。 　　（2）电化学法。有些化学反应过程会放出质子氢（H+），可用灵敏的pH计或NaOH溶液滴定等方法追踪其变化，从而计算出欲测物的含量或活力。例如，葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，用NaOH溶液滴定该酸的含量，便可求出葡萄糖氧化酶的活力。 　　（3）免疫分析法。在有胰岛素抗体的前提下，可利用该抗体与待测胰岛素之间发生特异反应的性质，结合核素或非核素标记，就可对胰岛素进行灵敏的定量分析。 　　（4）生物活性法。胰岛素是一类可降低机体血糖的肽类物质，其含量变化与有机体降低血糖的程度成正比。其量可用小鼠惊厥法、家兔血糖降低法和放射受体分析法进行测定。该法专一性强，但操作繁琐。 　　解题思路 　　依据知识概略（2），因胰岛素不属于酶类物质，可将B法排除在外。依据知识概略（1）、（3）和（4），因胰岛素是由氨基酸（包括色氨酸和酪氨酸）组成，并且是有生物活性的物质，也可通过胰岛素标准品制备出抗体，故可用光谱法、免疫分析法和生物活性法进行测定。光谱法灵敏、快速，而免疫分析法和生物活性法则均较专一。 　　简明答案 　　测定方法可以选择A、C和D;而较精确的方法应选择C和D。 　　2.单项选择题 　　在用适当的溶液对有效成分进行抽提时，选择抽提液的pH应是（）。 　　A.偏离其等电点的范围B.等同其等电点的范围 　　C.偏离其等电点的稳定范围D.酸性pH 　　E.喊性pH知识概略 　　（1）蛋白质（包括酶）和核酸的溶解度及稳定性均与pH有关； 　　（2）蛋白质（或酶）是具有等电点的两性电解质物质，当它所处缓冲溶液的pH与其等电点相同时溶解度*低； 　　（3）不同结构的物质，处在各种pH环境中的溶解度和稳定程度是不相同的； 　　（4）一般选择抽提液的pH应在偏离其等电点的稳定范围内，这样既能增加有效成分的溶解度，又能保持其活性。通常抽提碱性蛋白质宜选用低pH溶液，而抽提酸性蛋白质则宜选用高pH溶液，或者使用调至一定pH的有机溶液。解题思路 　　依据知识概略（2），可以排除B;依据知识概略（3）可以排除A、D和E; 　　又依据知识概略（1）和（4），选择C是正确的。 　　简明答案 　　C。 　　3.单项选择题 　　根据有效成分和杂质理化性质的差异性，设计出的纯化大分子物质方案，欲评价其可行性的方法有（）。 　　A.回收率B.纯化倍数C.纯度 　　D.纯化倍数和回收率E.有效成分的结构知识概略 　　（1）纯化方案是指在纯化某有效成分时，将两种或两种以上能逐步提高纯度、去除杂质的方法，有机地优势互补、灵活调控、联合运作全过程的总称。 　　（2）遴选分离有效成分方法的依据是抽提液中所含有效成分与杂质之间的理化性质的差异性。 　　（3）纯化是为了提高有效成分的纯度，但在此期间应既要保持其结构稳定，又能使其活性不变。衡量纯化方案可行性的主要指标是被纯化物质的回收率和纯化倍数。 　　①评价纯化方案，实际是对组成纯化方案中的相关方法的评价。凡是在特定实验中，能较快增加纯化倍数和缓慢降低回收率的方法均有应用价值。 　　②纯化倍数=每步的比活力/粗抽提液的比活力；纯化倍数越高表示该方法去除杂质越多，有效成分的纯度提高得越快。 　　③回收率=每步的总活力/粗抽提液的总活力×100%，回收率则视降低的速率而定，通常小于100%。在一般情况下，回收率都小于100%，而且每经过一步纯化，有效成分的含量都会有所降低，但降低速率应较缓慢。 　　（4）评价纯化方法的可行性不仅要考虑有效成分的纯度（纯化倍数），而且还要考虑其回收率。 　　解题思路 　　依据知识概略（1）、（2）和（3），评价纯化方案可行性时可以排除C、E；依据知识概略（3）、（4），应排除A、B，而D是正确的答案。 　　简明答案D。 　　【各类题型】 　　一、填空题 　　1.影响抽提有效成分效果的八大因子是_____、_____、_____、_____、温度、搅拌、金属离子和抽提液与抽提物的比例。 　　2.有效成分是指欲纯化的某种_____。而有效成分以外的其他物质称 　　3.选择分离有效成分方法的依据，一般是分析抽提液中所含___理化性质的差异性。 　　4.在制备生命大分子的过程中，建立测定方法的目的是为了追踪_____的去向和____。 　　5.定性和定量测定蛋白质和核酸的光谱法包括_____、____、____，另外还有表观光谱法-浊度法。 　　6.蛋白质中在280nm处有*大吸光值的氨基酸残基是___、____，在260nm处有*大吸光值的是苯丙氨酸。 　　7.核酸在260nm附近具有*大的吸光值（有*大吸收峰），是因为核酸中含有共轭双键的_____和____。 　　8.抽提是指采用_，把原材料中有效成分和杂质通过反复萃取，逐步将其有效成分_____地分离、收集的过程。 　　9.在选择提取蛋白质或核酸的材料中，往往都存在一些___，能与欲抽提的蛋白质或核酸在一定条件下发生水解反应，从而导致回收率降低，活性丧失。解决的办法是在提取液中添加适量_____或_______，尽量减少水解酶的作用。 　　10.对纯化方案的评价，实际上是对组成纯化方案中的相关方法的评价。凡是在特定实验中能较快增加____和缓慢降低_____的方法均有应用价值。 　　11.一个酶活力单位通常是指在一定的条件下，每分钟转变_____底物所需的酶量，即一个IU（为国际酶活力单位）。 　　12.酶的比活力是指每毫克酶蛋白所____，它是酶制剂纯度的一个指标。 　　13.某些物质被一定波长的光照射时，会在特定时间内发射出___波长的光，这种光就称为荧光。荧光法的精确性、重复性和灵敏度均比____好。 　　14.将冰冻抽提液置于冻干机中，在真空状态下可以由__直接变为____的方法称冰冻干燥法，该法能起浓缩作用。 　　15.把盛抽提液的透析袋（由半透膜制成）埋在吸水力强的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG，分子质量>20kDa）或甘油中，袋内的_____可透过半透膜逐渐移至_____，有效成分则留在___，抽提液（10ml）可很快（1h）浓缩到几乎无水程度，此法称为浓缩透析。例如，将装有盐析液的透析袋放在蒸馏水或缓冲液的烧杯中进行透析，可除去小分子盐的过程也称透析。 　　16.将体积比较大的抽提液经__或吸附等方法处理，致使其体积缩小，即为浓缩。 　　二、判断题（标出对与错） 　　1.在相同条件下，测定相等摩尔浓度的各蛋白质时，所获得的摩尔消光系数是一致的。（） 　　2.酶活力单位可以定义为在25°C下，每分钟转变1pmol底物所需的酶量。（） 　　3.适pH与pI（等电点）是酶所具有的基本性质，两者之间有一定相关性，通常具体数值比较接近或相同。（） 　　4.一般用于测定酶活力的常用方法是可见分光光度法，较灵敏的方法是同位素标记-分光光度法。（） 　　5.在制备蛋白酶制剂时，产品的回收率绝对小于100%。（） 　　三、论述题 　　1.请解释酶活力和比活力在酶纯化过程中的变化，分别有什么指标意义？ 　　2.白明胶溶液在280nm几乎没有紫外吸收性质，为什么？ 　　3.在纯化胆红素还原酶的过程中，测定了几个步骤的酶活力、蛋白质含量、比活力、纯化倍数及回收率（表1-1），试分析该纯化方案的可行性。 　　4.动物胰脏中存在胰岛素、胰蛋白酶等物质，在提取胰岛素时，如何防止胰蛋白酶对其的水解破坏作用？ 　　5.何谓标准曲线？怎样绘制标准曲线？如何从标准曲线求得消光系数？又如何利用消光系数求得某物质的含量？ 　　6.试比较在分离、制备蛋白质和核酸过程中，所用方法的差异性说明了什么。 　　7.常用于破碎细胞的方法有几种？破碎细胞的目的何在？ 　　四、计算题 　　1.骨骼肌的无细胞粗抽提液每毫升包含蛋白质32mg，在适宜条件下，该抽提液以每分钟0.14μmol的速率催化一个反应。用硫酸铵沉淀法分离50ml上述抽提液，将硫酸铵饱和度为20%～40%的沉淀物重新溶于10ml溶液中，测得其蛋白质含量为50mg/ml。取该溶液催化一反应，其速度为0.65μmol/min。试计算纯化倍数和回收率。 　　2.2g小白菜叶的抽提液15ml，稀释20倍后作为样品液，以牛血清白蛋白为标准品，运用考马斯亮蓝法测定其含量，该样品液的吸光值（absorbency）为0.5，标准蛋白的消光系数为0.8个A/（100mg ml），计算白菜的蛋白质含量（mg/g）和百分含量。 　　3.如何精确配制100ml浓度为1mg/ml牛血清白蛋白的生理盐水溶液。 　　4.如果某标准物在标准曲线上查得其浓度为1mg/ml时的4=0.65[0.65A/（mg ml）]，如果该物质的分子质量为6.7万Da，请求出其两个消光系数（extinctioncoefficient，百分消光系数和摩尔消光系数）。若一个未知样品溶液的A咖为0.55，求其蛋白质含量是多少？ 　　5.如何配制0.2mol/L、500ml的磷酸钠盐缓冲液（pH5.8）（已知NazHPO4 2H2O和NaH2PO4 H2O的相对分子质量分别为178.05和138.0，据文献，配制0.2mol/L、pH5.8的溶液时，0.2mol/L的碱盐和酸盐之比为8.0：92.0）。 　　6.某酶制剂2ml内含脂肪10ng、糖20ng、蛋白质25mg，其酶活力相当于市售酶制品（每克含2000酶活力单位）10mg，问某酶制剂的比活力是多少（因酶制剂中脂肪和糖的含量甚微，故在此忽略不计；均以同样单位下蛋白质含量计算）？ 　　7.已知DNA260/280值为1.8，RNA260/280值为2.0。今有一不含蛋白质等杂质的核酸纯品，其值为1.9，问在1g该样品中RNA和DNA各含多少克（1个DNA260吸光值相当于53mgDNA，1个RNA^吸光值相当于40μg