包邮生物遗传标记与应用

    笔者编著的《DNA分子标记技术在植物研究中的应用》一书出版发行已近三年。随着学科
和信息技术的发展，DNA分子标记技术不仅在植物研究中的应用又有新的进展，而且在动物和
微生物研究中的应用硕果累累。这些内容和诸如ITS和DGGE等DNA分子标记技术在《DNA
分子标记技术在植物研究中的应用》一书中尚未提及；同时，DNA分子标记和形态标记、细胞
学标记及生化标记是生物遗传信息在不同水平上形式的体现，其间有着本质的联系，在研究和应
用中能够相互补充和印证，因此，编者把上述内容也增补到本书中，作为《DNA分子标记技术
在植物研究中的应用》一书的再版，以飨读者。通过这些内容的增补和更新，相信本书能够比较
全面地反映和跟上学科的发展。
    另外，本书也对《DNA分子标记技术在植物研究中的应用》一书中原有的部分章节进行了
修改和补充。例如，把原书中的“引言”和“原理”两部分精简为“原理”部分，删除相关章节
内具体植物的研究分析方法和章后所附的延伸性内容等，以减少篇幅，使之更有所值；相应地，
本书适当增加了相关技术在动物和微生物中应用的内容，意在使《生物遗传标记与应用》的应用
范围更广，增强其实用性。以使整个生物学范围内的几乎所有分支学科及相关学科的学生、教师
和科技工作者都可阅读本书。同时，根据读者反馈的信息，本书适当保留了《DNA分子标记技
术在植物研究中的应用》一书的特点——例如，一是将原理、方法与应用以及实例等内容合理编
排，使之结构紧凑，便于理论与实际结合，即使初学者也能按照其进行操作实验，技术方便实
用，可操作性强等；二是结合笔者的学习、教学与研究工作，在书中融入了相关研究的成果及实
例；三是将相关的有重要参考价值的资料和文献附于章节后，方便读者深入查阅和学习。
    本书编写分工如下：绪论由周延清和张改娜编写，**章至第七章由张改娜编写，第八章、
第十九章至第二十一章和附录由杨清香编写，第九章、第十一章、第十四章、第十五章、第十七
章和第十八章由周延清和邓传良编写，第十章由周延清、高武军、邓传良编写，第十二章、第十
三章和第十六章由周延清和高武军编写，第二十二章由周延清编写。周延清负责全书的统稿
工作。
    为突出本书的学术性和应用价值，本书在编写过程中参考了国内外遗传标记方面的先进理论
和部分文献资料，在此特向原作者表示深深的敬意和衷心的感谢!
    由于编著者水平有限，书中不妥之处在所难免，恳请专家、同行和读者批评指正。
    周延清
    2008年1月

第四篇
 DNA分子标记技术原理方法与应用
    第八章  DNA提取和检测
    DNA分子标记技术实验和其他许多分子生物学实验一样，是从研究生物个体对象的基因组
脱氧核糖核酸(deoxynucleic acid，DNA)开始的，因此，能否得到高质量的基因组DNA自然成
为DNA分子标记技术实验关键的**步。只有高质量的DNA，才能够获得理想的DNA带谱。
要想得到高质量的DNA，科研工作人员在DNA的提取过程中既要防止DNA的降解和变性，又
要尽量保持其在生物体内的天然状态。要提取天然的、具有生物活性的DNA，必须在温和的条
件下，防止pH过高、过低和DNA酶的污染，避免剧烈振动与搅拌。
    在实验时要根据所用的材料及所要分析的DNA类型进行选择。就每一类提取DNA的方法
而言，具体的提取方法相当多，但是不同的植物材料，DNA提取的方法往往有很大的差异，本
章将着重介绍一些具体的动植物和微生物DNA提取方法。
  一、植物DNA提取方法
  (一)植物总DNA的提取方法
  1．CTAB方法
  十六烷基三乙基溴化铵(cetyltriethylammonium bromide，CTAB)是一种去污剂，可以与核
酸形成复合物。该复合物在高盐溶液(NaCl浓度>O．7mol／L)中可以溶解并且稳定存在；在低
盐溶液(NaCl浓度<O．3mol／L)中因溶解度降低而沉淀，而大部分蛋白质和多糖仍然溶于溶
液中。
    CTAB法技术的关键是提取过程中加入10％(质量分数)CTAB提取液和1％(质量分数)
CTAB沉淀缓冲液的量一定要准确，否则CTAB与核酸的复合物沉淀不易产生或者得到的DNA
部分降解。CTAB法所用的提取缓冲液中含有一定量的B羟基乙醇，可防止酚类氧化，如果植物
材料中酚类较多，其浓度可增加至6％(体积分数)。
    (1)新鲜的植物组织总DNA的提取方法
    ①试剂
    a．2×CTAB提取缓冲液：100mmol／L Tris—HCl(pH8．O)，20mmol／L EDTA，1．4mmol／L
NaCl，2％(质量分数)CTAB，40mmol／L p巯基乙醇。
    b．10％(质量分数)CTAB：10％(质量分数)CTAB，O．7mol／L NaCl。
    c．1×CTAB沉淀缓冲液：50mmol／L Tris-C1(pH8．O)，10mmol／L EDTA，1％(质量分数)
CTAB，20mmot／L 巯基乙醇。
    d．1mol／L乙酸铵。
    e．7．5mol／L乙酸铵。
    ②操作步骤
     称取适量新鲜的植物材料，置于液氮中，充分研磨成粉末状。
    b．将粉末状材料转移到预冷的离心管中，立即加入等体积65'C预热的2×CTAB提取缓冲
 液，充分混匀，在65℃水浴中保温10～20min，其间不时摇动。
    c．加入等体积的氯仿一异戊醇，轻轻颠倒离心管，混匀，室温下，12000r／min离心
10～20min。
    d．把上清液转入另一洁净的离心管中，加入1／10体积的10％(质量分数)的CTAB，混
匀，加入等体积的氯仿一异戊醇，轻轻颠倒离心管混匀，室温下12000r／min离心10min。
    e取上清液，重复步骤d．一次。
    f．将上清液转入另一离心管中，加入1～1．5倍体积的1×CTAB沉淀缓冲液，混匀，室温
下静置30min使沉淀生成。
    g．3500～4000r／min离心5rain，取沉淀，晾干备用。
    h．按照每克材料0．5ml的比例加入lmol／L乙酸铵溶液，使沉淀完全溶解，再加入7．5mol／L
乙酸铵溶液至终浓度为2．5mol／L。
    i．加入2倍体积的异丙醇，混匀，室温下静置10min。
    i．10000r／min离心5min，收集沉淀。或者直接用玻璃棒缠出DNA纤维。
    k．用70％(体积分数)乙醇漂洗沉淀3次，吹干，沉淀溶入适当体积的TE缓冲液中。加
入ltd 10rug／ml RNase，4。C贮存备用。
    (2)冷冻干燥的植物组织总DNA的提取方法
    ①试剂
    a．1×CTAB提取缓冲液：2×CTAB提取缓冲液[100mmol／L Tris—HCl(pH8．0)，
20mmol／LEDTA，1．4mmol／L NaCl，2％(质量分数)CTAB]稀释1倍，用前每100ml加入
O．14ml b巯基乙醇。
    b．1mol／L NaCl。
    c65％(体积分数)乙醇。
    d．80％(体积分数)乙醇。
    e无水乙醇。
    f．其他试剂同(1)①。
    ②操作步骤
    a．称取1g冷冻干燥的植物材料，加入3～4g铝粉充分研磨。
    b．把冻粉转入预冷的离心管中，立即加入0．6～15ml 1×CTAB提取缓冲液，轻轻搅拌，充
分混匀，65℃水浴保温10～20min，其间不时摇动。
    c冷却至室温，加入等体积的氯仿一异戊醇，轻轻颠倒离心管，混匀，20。C 12000r／min离
心10min。
    d．将上清液转入另一离心管中，加入1／10体积的10％(质量分数)CTAB，轻轻混匀，重
复步骤c和d．各一次。
    巴加入等体积1×CTAB提取缓冲液，轻轻混匀，室温下放置30min以上，使沉淀生成。
    f．室温下，3500～4000r／rain离心10min，收集沉淀，晾干备用。
    g．将沉淀溶于400pl lmol／L NaCl，65。C水浴保温助溶。
    h．加入2倍体积的无水乙醇，一70。C沉淀30min，或者一20。C过夜。
    i．1500r／min离心2min，回收沉淀。
    j．依次用65％(体积分数)、85％(体积分数)乙醇漂洗沉淀，吹干，溶于无菌水中备用。
    ③注意事项
    a．CTAB溶液在15。C以下会沉淀，因此不能在低温下进行操作。
    b．10％(质量分数)CTAB溶液很黏稠，取液时将其预加热至56℃。
    c对于含多酚类物质多的材料，提取缓冲液中加入1％(质量浓度)PVP；对于多糖含量高
的材料，提取缓冲液中加入CTAB的浓度应等于或大于3％(质量分数)。
    2．用于PCR的DNA粗提液微量制备
    (1)植物叶DNA的粗提取方法
    ①试剂
    a．O．25mol／L NaOH。
    b．O．25mol／L HCl。
    c．Tris缓冲液：0．5mol／L Tris，pH8．0。
    d．0．25％(体积分数)的乙基苯基聚乙二醇(NonidetP-40)润湿剂。
    ②操作步骤
    a．把叶组织放入1．Sm!的Eppendorf离心管内，置于冰上。
    b．向离心管内加入40rd 0．25mol／L NaOH，煮沸30。
    c．再向离心管内加入40／d O．25mol／L HCl和20rd Tris缓冲液，煮沸2rain。
    d．取1～2弘l用于PCR扩增实验或者4℃储藏 备用。
    ③注意事项
    a每次PCR所用的叶组织量不超过2mm2。
    b．PCR所用的引物量和Taq DNA聚合酶量分别为一般PCR的2．5倍和2倍。
    c所提取的DNA只用于PCR扩增实验。
    (2)植物根、茎和愈伤组织等组织DNA的粗提取方法
    ①试剂
    L O．5mol／L NaOH。
    b．100mmol／L Tris(pH8．O)。
    ②操作步骤
    a．称取5～10mg供试材料，置Eppendorf管中，加入50～100弘1 0．5mol／L NaOH，使用细玻
璃棒捣碎，静置片刻。
    b．从中取5／d，放人一洁净Eppendorf管中，加入100mmol／L Tris(pH8．0)溶液45～450t11，
混匀，备用。
    ③注意事项  此法主要用于用PCR大量快速检测转化体。PCR检测时取1μl。
    3．十二烷基硫酸钠(SDS)法
    利用高浓度的阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulphate，SDS)使DNA与蛋
白质分离，在高温(55～65。C)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然
后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的
DNA用酚／氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
    (1)试剂
    a．提取缓冲液：100mmol／L Tris—HCl(pH8．O)，50mmol／L EDTA(pH8．O)，500retool／L
NaCl，10mmol／L口一巯基乙醇。
    b．10％(质量浓度)SDS。
    c 5mol／L KAc。
    d．1mol／L NaAc。
   e 70％(体积分数)的乙醇。
    (2)操作步骤
    ①简易大量粗提取SDS方法
    ．在5mi的离心管中，加入15ml提取缓冲液和lml 10％(质量浓度)SDS，混匀，于65℃
预热。
    b．称取去除中脉的植物叶片等材料4g，置液氮中研磨成粉状。
    c．将冻粉转入上述离心管中，混匀，65℃保温20min，其间摇动1～2次。