瓜菜种质资源鉴定.核心种质构建与遗传多样性分析

**章辣椒种质资源对南方 根结线虫抗性的鉴定 辣椒（Capsicum spp，2n=2x=24）为茄科（Solanaceae）辣椒属（Capsicum）一年或多年生草本植物，原产于中南美洲（Qin et al,2014），于明代传入中国。大量研究表明辣椒果实中含有的辣椒素类物质具有缓解疼痛（Anand et al,2011）、消炎（Kim et al.,2003）、减肥（Ludy et al.,2012）和抗肿瘤活性（Anandakumar et al.,2012）。辣椒属包括5个栽培种，分别为一年生辣椒（Capsicum annuum），灌木状辣椒（Capsicum frutescens），中国辣椒（Capsicum chinense），下垂辣椒（Capsicum baccatum）和茸毛辣椒（Capsicum pubescens）（孟金贵等，2012）。一年生辣椒是世界上栽培*为广泛的种，在发达国家蔬菜产量方面，辣椒仅次于番茄，位居第二位（Heidmann et al.,2011）。 根结线虫（Meloidogyne spp）是严重为害辣椒作物生产的世界性病害（Barbary et al.,2015），*常见的有南方根结线虫（M incognita）、花生根结线虫（M arenaria）、爪哇根结线虫（M javanica）及北方根结线虫（M hapla），其中以南方根结线虫对辣椒的为害*重，尤以长期重茬保护地为重。线虫侵入留下的伤口，又成为辣椒疫病、立枯病和枯萎病等土传性病原菌侵入的通道，进一步加速根系的腐烂，致使植株枯死，造成绝收（蒲金基等，2002）。培育抗病品种是防治根结线虫*为经济、有效的防治方法（Aguiar et al.,2014）。鉴定高抗根结线虫辣椒种质材料，是高效培育辣椒抗性品种的关键所在。Martin在1948年首次报道了辣椒品种对根结线虫的抗性，标志着辣椒抗根结线虫育种的开始。Hare（1957）首次在灌木状辣椒‘Santaka XS’中发现了单显性抗根结线虫基因N，该基因对南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种主要的根结线虫具有抗性。除N基因外，目前在辣椒中发现并且命名的抗线虫基因包括：Me1、Me2、Me3、Me4、Me5、Me7、Mech1、Mech2和Cami，这些基因的来源、抗谱范围、抗病机制、对温度的稳定性存在显著差异（BleveZacheo et al.,1998；Fery et al.,1998；DjianCaporalino et al.,2001；DjianCaporalino et al.,2007；Chen et al.,2007）。截至目前，尽管已经发现多个根结线虫抗性基因，但是仍然存在抗病资源材料单一、遗传背景狭窄、温敏反应差异较大、抗性较弱、转育困难等问题。并且随着根结线虫新的种群的出现，已发现的抗性基因逐渐失去抗性，目前迫切需要筛选和鉴定抗根结线虫的辣椒种质资源及发掘新的抗病基因。本研究将对67份不同类型的辣椒种质资源进行根结线虫抗性鉴定，结合聚类和隶属函数分析方法，明确不同材料对根结线虫的抗性水平，为辣椒根结线虫抗性育种提供抗源。 一、材料与方法 （一）试验材料 试验于2015—2016年在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所培养室进行。供试辣椒种质资源共67份，26份中国辣椒，34份一年生辣椒，6份灌木状辣椒，1份野生辣椒，不同种质间株高、株幅、叶片大小、果实大小等性状存在显著差异（表1-1）。种子浸种催芽后，播种于营养钵中，播后置培养室内培养，待种子萌发后，每盆留1株，每份材料种植5盆，盆内栽培基质（营养土蛭石=31）经121℃高温杀菌2h。 表1-1辣椒种质资源 材料名称类型材料名称类型材料名称类型 Rela 2中国辣椒L5273中国辣椒L2334一年生辣椒 L506M中国辣椒L538M中国辣椒L211SM一年生辣椒 L512* L518中国辣椒L5291中国辣椒M2S*F11一年生辣椒 L5221M中国辣椒Rela 5一年生辣椒13SM113一年生辣椒 L504M中国辣椒L2872一年生辣椒M16*F20一年生辣椒 L5152中国辣椒M8*F9S一年生辣椒L28822一年生辣椒 L512M中国辣椒14SM85A*14SM85B一年生辣椒L2022M一年生辣椒 L5071中国辣椒L319一年生辣椒L2891一年生辣椒 L5111MSM中国辣椒13SM1001一年生辣椒L2456一年生辣椒 L518M中国辣椒M12S*F9一年生辣椒L216111M一年生辣椒 L539中国辣椒13SM821一年生辣椒L2855一年生辣椒 L5301中国辣椒13SM83M一年生辣椒M16*L211一年生辣椒 L5371中国辣椒13SM871一年生辣椒L2317一年生辣椒 L5421中国辣椒13SM79一年生辣椒L301M一年生辣椒 L544M中国辣椒L2921一年生辣椒L316灌木状辣椒 L543M中国辣椒M2 *F12一年生辣椒L317灌木状辣椒 L528M中国辣椒13SM50一年生辣椒L311灌木状辣椒 L5161M中国辣椒13SM1178一年生辣椒L314灌木状辣椒 L5251M中国辣椒13SM78一年生辣椒L3061灌木状辣椒 L535M中国辣椒13SM1592一年生辣椒L315灌木状辣椒 L5305中国辣椒M11S*F4一年生辣椒L801M野生辣椒 L517M中国辣椒13SM120一年生辣椒 L5262中国辣椒13SM1112一年生辣椒 (二)根结线虫的收集与鉴定 收集海南省辣椒主栽区被线虫感染的辣椒根系，用小镊子挑取卵块并将挑取的卵块冲洗入浅盘中的卫生纸上，25℃黑暗孵化，收集新鲜孵化的2龄根结线虫幼虫，置液氮中冷冻，用力研磨成粉末，提取线虫基因组DNA，根据已公布的线虫特异引物鉴定线虫的种类（Hu et al.,2011）（表1-2）。 表1-2根结线虫种类鉴定引物序列 线虫种类正向引物序列（5′3′）反向引物序列（5′3′） 根结线虫（通用）GGGGATGTTTGAGGCAGATTTGAACCGCTTCGGACTTCCACCAG 南方根结线虫GTGAGGATTCAGCTCCCCAGACGAGGAACATACTTCTCCGTCC 花生根结线虫TCGGCGATAGAGGTAAATGACTCGGCGATAGACACTACAACT 爪哇根结线虫GGTGCGCGATTGAACTGAGCCAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC 北方根结线虫GGATGGCGTGCTTTCAACAAAAATCCCCTCGAAAAATCCACC 象耳豆根结线虫AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTGTCAGTTCAGGCAGGATCAACC (三)根结线虫扩繁与抗性鉴定 将鉴定过的根结线虫接种于温室栽培的茄门甜椒上进行扩繁，一般培养6～8周即可从感病植株的根上收集线虫卵块，置于室温中孵化。参照DjianCaporalino等（2007）的辣椒南方根结线虫鉴定方法对辣椒种质进行抗感病鉴定。辣椒五叶期每植株接种600条二龄南方根结线虫，整个生长期注意控水和控温（18～28℃）。接种60d后对植株进行抗性鉴定。先将辣椒根洗净，放入01g/L的伊红黄溶液中染色30min，卵块被染成红色，然后调查每株根系的卵块数。采用Boiteux等（1996）的方法计算根结指数（GI）和卵粒指数（EI）。其中GI=单株根结数/单株根鲜样质量，EI=单株卵粒数/单株根鲜样质量。 （四）隶属函数值计算 参照徐小明等（2008）的隶属函数值计算方法。抗病指标的隶属函数值=1－(X－Xmin)/(Xmax－Xmin)，X为接种50d后辣椒种质某指标测定值，Xmax为所有供试种质该指标的*大值，Xmin为所有供试种质该指标的*小值。隶属函数值越大，表明其抗南方根结线虫的能力越强。 （五）统计分析 采用SPSS160软件进行数据处理，计算平均值、标准差和变异系数，经欧氏距离平方法计算样本间距离，采用离差平方和法进行聚类。 二、结果与分析 （一）根结线虫的收集与鉴定 收集了海南省辣椒主栽区被线虫感染的辣椒根系，挑取卵块进行孵化，收集2龄根结线虫幼虫，置液氮中冷冻，用力研磨成粉末，提取线虫基因组DNA。以线虫基因组DNA为模板，利用已公布的线虫特异引物进行PCR扩增，根结线虫通用引物与南方根结线虫特异引物扩增片段大小与目的片段大小一致，其他引物组合无扩增结果，该分析结果表明采集的线虫样本为南方根结线虫（图1-1）。 图1-1线虫种类分子鉴定结果 （1：根结线虫（通用）；2：南方根结线虫；3：花生根结线虫；4：爪哇根结线虫；5：北方根结线虫；6：象耳豆根结线虫）