基因工程——动物细胞制药关键技术

**章 动物细胞培养 001
**节 动物细胞培养基础知识 002
一、基本概念 002
二、动物细胞培养条件 003
三、动物细胞培养实验室 004
四、无菌技术 006
第二节 动物细胞培养技术 007
一、动物细胞冻存与复苏 007
二、动物细胞传代 009
三、动物细胞悬浮驯化及无血清培养 011
四、动物细胞分批培养 015
五、动物细胞补料分批培养 016
六、动物细胞灌流技术培养 022
第三节 动物细胞生物特性分析 025
一、动物细胞生长曲线和倍增时间分析 025
二、动物细胞增殖测定 028
三、动物细胞凋亡检测 031
四、动物细胞周期检测 036
参考文献 038

第二章 动物细胞载体 041
**节 质粒载体构建 042
一、目的基因获取 042
二、限制性内切酶酶切 046
三、目的片段和载体连接 048
四、重组子转化 050
五、重组载体筛选 052
六、重组载体鉴定 052
第二节 病毒载体构建 056
一、杆状病毒表达载体 056
二、慢病毒载体 057
三、腺病毒载体 059
四、逆转录病毒载体 060
参考文献 061

第三章 目的基因导入 065
**节 动物细胞转染 066
一、脂质体转染 066
二、聚乙烯亚胺转染 067
三、电穿孔转染 068
四、影响细胞转染的因素 069
第二节 细胞转染效率检测 070
一、流式细胞仪检测 071
二、荧光显微镜检测 071
参考文献 072

第四章 重组稳定细胞株筛选和评估 075
**节 重组稳定细胞池筛选 076
一、常用的抗生素筛选标记 076
二、遗传霉素筛选 078
三、DHFR筛选 079
四、GS筛选 080
第二节 重组单克隆细胞株分离 081
一、有限稀释法 081
二、流式细胞荧光分选技术 082
三、ClonePix 083
四、克隆环法 084
五、其他筛选方法 085
第三节 重组稳定细胞系评估 086
一、细胞污染检测 086
二、细胞系鉴定 087
三、外源基因整合分析 089
四、重组蛋白表达分析 098
参考文献 101

第五章 重组蛋白分离纯化 103
**节 重组蛋白纯化策略及设备 104
一、重组蛋白纯化策略 104
二、重组蛋白纯化设备 107
第二节 重组蛋白沉淀和膜分离技术 116
一、蛋白质沉淀法 117
二、膜分离技术 118
第三节 重组蛋白分离色谱技术 119
一、亲和色谱法 120
二、疏水色谱法 122
三、凝胶过滤色谱法 124
四、离子交换色谱法 126
五、反相色谱法 129
参考文献 131

第六章 重组蛋白药物鉴定与分析 135
**节 蛋白质理化特性 136
一、分子量测定 136
二、等电点与电荷异质性分析 141
三、肽图分析 144
四、氨基酸组成分析 145
五、N端氨基酸测序 150
六、C端氨基酸测序 152
七、二硫键分析 153
八、高级结构分析 155
第二节 蛋白质含量分析 159
一、凯氏定氮法 159
二、Lowry法 161
三、BCA法 162
四、Bradford法 164
五、紫外吸收法 166
六、高效液相色谱法 166
第三节 蛋白质纯度分析 168
一、宿主细胞蛋白残留分析 168
二、宿主细胞DNA残留分析 170
三、残留抗生素检测 172
四、其他成分检测 173
第四节 糖基化修饰分析 181
一、分离富集亲和技术 182
二、糖蛋白鉴定/糖基化位点的确定方法 187
三、糖链结构分析 189
第五节 生物学活性测定 206
一、体外法评估 207
二、体内法评估 211
第六节 免疫化学特性分析 213
一、亲和力测定 213
二、抗原结合表位测定 217
参考文献 219

第七章 重组蛋白药物新技术 223
**节 人工智能与蛋白药物设计 224
一、核苷酸及蛋白质相关数据库 224
二、基因信息分析及密码子优化 226
三、蛋白质信息分析及结构预测 241
四、人工智能设计 255
第二节 miRNA筛选与应用 269
一、miRNA筛选 269
二、miRNA应用 273
第三节 基因编辑技术 279
一、动物细胞CRISPR基因敲除 279
二、动物细胞基因敲入 289
第四节 表观遗传学技术 299
一、DNA甲基化分析 299
二、组蛋白修饰分析 305
三、非编码RNA分析 314
第五节 DNA与蛋白质相互作用分析 323
一、凝胶迁移实验 323
二、DNaseⅠ足迹实验 330
三、酵母单杂交系统 337
四、染色质免疫沉淀 351
五、噬菌体展示技术（DNA与蛋白质相互作用） 354
参考文献 356

附录1 常用缓冲液及试剂的配制 363

附录2 中英文词汇表 369