大青杨抗逆基因工程育种/林学基础研究系列

1大青杨及其研究概述 　　杨树是杨柳科（Salicaceae）杨属（Populus）落叶乔木植物的总称。杨树具有适应性强、生长速度快等特性，已经在世界范围内广泛栽培，同时杨树遗传资源丰富，无性再生能力强，轮伐周期相对较短，被普遍认为是未来生物能源的重要来源。大青杨（Populusussuriensis）是东北林区主要的乡土树种（苏晓华等，2001），耐寒、速生，是山地营造速生用材林的主要树种之一，也是我国东北地区青杨组树种中分布*广、利用价值*大的树种（刘玉庭和方旭东，2001）。其干形通直，木材洁白，是造纸及胶合板材极好的原料（王冰等，2003）。随着天然林的不断采伐，人们开始营造大青杨的人工林，而林地条件需要抗旱、耐贫瘠且适应性强的大青杨新品种（姜洋等，2017）。常规育种周期长、工序复杂，且受外界环境的影响大，不能满足短期内有目的地定向培育杨树新品种的需要。随着现代分子生物学技术的发展，杨树育种发生了前所未有的变革，显著地提高了育种效率并扩展了育种目标。由于杨树无性繁殖容易，易于离体操作，基因组小，较易鉴定、分离和克隆基因，因此成为研究木本植物的模式植物。目前，杨树在很多方面的研究取得了令人瞩目的成果，如抗病虫害、耐盐碱、改良材性、调控生长、开花发育等，并且有很多抗病虫害和耐盐碱转基因杨树进入了田间试验、环境释放和生产性试验，甚至是商品化阶段（苏晓华等，2003）。大青杨抗逆基因工程育种近年来受到了极大的关注。 　　1.1青杨组织培养的研究概述 　　利用杂交育种得到的具有杂种优势的杂交品种，采用嫁接、根繁、接种等繁殖方法进行育苗能保持其优良性状，但是速度较慢、成活率低、受季节限制、生长周期长。在细胞全能性理论的基础上，利用组织培养技术繁殖杨树苗木，能够克服传统育种的缺点，短期内获得大量苗木。至今，杨树已成为林木组织培养（简称组培）研究中应用*为广泛的树种之一。 　　1.1.1青杨基因资源 　　青杨组（Sect.Tacamahaca）是杨属中*大的派系（苏晓华等，2001），有34个种属，21个变种，目前研究的青杨组树种主要有大青杨、香杨（Populus koreana）、小叶杨（Populus simonii）、甜杨（Populus suaveolens）、辽杨（Populus maximowiczii）等。据了解，我国的青杨组树种多分布于海拔比较高的地域（田晓明和谭晓风，2009），越是在环境条件复杂的地区生长，越有丰富的基因资源。 　　1.1.2青杨组织培养研究进展 　　杨树组织培养技术萌芽于20世纪30年代，Gautheret（1983）对欧洲黑杨（Populus nigra）的形成层组织进行了培养，并成功获得了愈伤组织。60年代，Mathes（1964）建立了三倍体美洲山杨（Populus tremuloides）的长期愈伤组织培养体系，并得到了根和芽。英国学者Wolter（1968）由欧洲山杨（Populus tremula）的愈伤组织经培养再生出正常的欧洲山杨小植株。Chalupa（1974）推广了Wolter的研究成果，此后几年，他对杨树组织的再生小植株进行生长速率、形态学及遗传组成方面的研究，发现无性再生小植株在形态和遗传组成上基本与母株相似。这一时期主要进行杨树愈伤组织培养。随后，Brand和Venverloo（1973）诱导杨树的根与茎段外植体产生不定芽，开始了杨树器官发育成不定芽的研究。 　　国内杨属植物的组织培养工作始于20世纪70年代辽宁省营口市杨树科学研究所的杨树离体花药培养。80年代，林静芳（1980）、陈道明和黄敏仁（1980）分别对银白杨（Populus alba）、加龙杨（Populus nigra cv.Blanc de garonne）进行组织培养研究。到目前为止，杨属中的小叶杨、三倍体毛白杨（Populustomentosa）、新疆杨（Populus alba var.pyramidalis）、青杨（Populus cathayana）、毛果杨（Populus trichocarpa）、香杨等均进行了组织培养再生研究（程云，2009）。 　　青杨组杨树组织培养方面的研究近几年逐渐增多，耿飒等（2006）以青杨的茎尖为外植体进行了研究并移栽成功。李开隆等（2009）利用香杨的顶芽和侧芽进行了组织培养研究。杜晓艳等（2011）以青海青杨茎段为外植体进行了组织培养，研究了不同浓度激素对其再生的影响，建立了其高效的组培再生体系。尽管青杨组中已有几种植物的组织培养获得成功，但关于大青杨组织培养方面的研究比较少。早些时期，李世承等（1995）以大青杨叶和嫩梢为外植体，得到了组培苗并且移栽成功，但是与用于基因转化受体系统还有一定差距。近些年，郭斌等（2011）以美洲黑杨与大青杨杂种（Populus deltoides×Populus ussuriensis）无性系的茎段作为外植体，研究了杂种无性系的离体培养及叶片再生体系，探讨了不同激素组合对杂种无性系不定芽诱导、分化、增殖及生根的影响。甄成（2016）研究了毛果杨不同取材部位、接种方式及外源激素组合对不定芽诱导的影响，建立了高效的毛果杨组培再生体系。姜洋等（2017）采用正交试验设计，研究了不同培养基和不同激素质量浓度配比对大青杨无菌苗叶片再生体系的影响，优化了大青杨植株的再生体系。 　　1.1.3组织培养过程中的影响因素 　　影响杨树组织培养再生效率的因素主要可分为几个方面，如外植体选择、基本培养基类型、生长调节物质、碳水化合物、温度、光照等。 　　1.1.3.1外植体 　　陈维伦等（1980）以山新杨（Populus davidiana×Populus bolleana）的叶作为外植体进行分化，发现带有叶柄的下段分化成芽的频率可达70%，而中、上段的分化频率极低，同一器官的不同部位其再生能力也有差异。Coleman和Ernst（1989）将16种基因型不同的美洲黑杨（Populus deltoides）茎段接种在相同的培养基中，研究发现不同基因型的植株其再生能力有很大差别。母本植株生理状态不同，外植体对生长素和细胞分裂素的敏感度也不同。郑均宝等（1995）发现，生根试管苗叶片的分化情况优于未生根试管苗，分化产生的不定芽数量多且健壮。外植体在消毒过程中会受到伤害，从而影响其再生能力，所以取材时取的不是*嫩的部位。在植株性别方面，母本植株性别不同，外植体再生能力也有差别。通常幼嫩植株的芽比成熟植株的芽再生能力强，而外植体越幼嫩，其再生能力越强，宋建英（2008）选择*幼嫩的种子作为外植体进行邓恩桉（Eucalyptus dunnii）再生的研究。Anuja（2013）以白杨及其杂交系进行实生苗实验，发现其下胚轴和茎尖分化成芽的能力高于子叶与叶片，同一植株上的不同器官其再生能力也有所不同。 　　外植体的消毒处理方式也影响再生效率。消毒剂在杀灭植物组织表面杂菌的同时，给植物本身也带来了伤害，在实际应用中，要根据具体材料对各种药剂的敏感度与消毒效果来确定适当的消毒剂及组合、浓度和处理时间。沈周高等（2006）发现中林2001杨（Populus deltoidescv.Zhonglin-2001）、南林95杨（Populus deltoids cv.Lux×Populus euramericana cv.I-45/51）和南抗杨（Populus deltoides cl.Nankang）三个品种的消毒剂浓度与材料的污染率、出愈率成反比，使用0.1%HgCl2溶液消毒4min效果*好。杜晓艳（2010）对青海青杨、三倍体山哈杨（Populus×liaohenica）外植体进行75%的乙醇处30s，0.1%HgCl2溶液消毒6～8min后，不定芽分化率较好。白卉等（2010）对山杨（Populus davidiana）进行70%酒精中浸泡15s，再用0.1%的氯化汞溶液消毒3min后，外植体的再生效率*佳。 　　1.1.3.2基本培养基 　　杨树组织培养中，MS（Murashige and Skoog medium）和WPM（woody plant medium）基本培养基较为常用，它们富含杨树所需的盐类。培养基*初是为烟草设计的，含盐量较高，对杨树的生根不利，在杨树的生根过程中，常用1/2MS和1/4MS培养基。而大量元素减半的培养基，则主要用于不定芽的分化。在培养杂交杨Populus alba×Populus tremula和Populus trichocarpa×Populus deltoides的过程中，由于铵离子富集在叶或茎段内，产生抑制愈伤组织诱导的现象。因此，在实际应用中，应根据材料品种及实验目的来选择基本培养基。另外，培养基是为木本植物设计的，主要特点是低盐。 　　1.1.3.3生长调节物质 　　杨树再生效率的高低与所用植物生长调节物质的种类、浓度及组合有很大的关系，植物激素有细胞分裂素和生长素两大类。生长素萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）用于杨树的生根，并能与细胞分裂素互相作用促进芽的增殖。生长素2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）虽能促进杨树愈伤组织的诱导，却会对器官的分化产生抑制作用。细胞分裂素是一类促进细胞分裂、诱导芽形成并促进其生长的植物激素。苄氨基腺嘌呤（BA）是主要用于大部分杨树不定芽诱导的细胞分裂素（DeBlock，1990），另外类细胞分裂素噻苯隆（TDZ）也正被应用于杨树腋芽增殖和不定芽分化的研究中，但其阻碍芽的伸长（Howeetal.，1994）。杨树上应用*多的是BA，其次是激动素（KT）和异戊烯基腺嘌呤（2-iP）。在杨树组织培养中，生长素混合使用的效果较好。使用极低浓度的TDZ就可诱导毛白杨叶产生大量的不定芽，用低浓度的TDZ代替价格昂贵的玉米素，与BA混合使用，可达到或超过玉米素的效果（Huetteman and Preece，1993）。其他生长调节物质对植物的生长也有一定作用，如赤霉素（GA）对杨树芽的分化无促进作用，但可促进芽的伸长。 　　1.1.3.4碳水化合物和pH 　　杨树组织培养中用到的碳水化合物是糖类和琼脂。 　　在植物组织培养中，糖类的主要作用是提供碳源和为植物提供能量物质，同时能调节培养基的渗透压。*常用的是蔗糖，此外还有葡萄糖和果糖。蔗糖是杨树组织培养中*常用的碳源，用量一般为25g/L左右。另外，使用果糖作为碳源能促进毛白杨休眠芽生长（陈维伦等，1991）。 　　琼脂是一种固化剂，本身不具任何营养，作为凝固剂使用，同时有吸附某些代谢有害物质的作用。琼脂浓度过高会使培养物不能与培养基密切接触，不能很好地吸收水和养分，琼脂浓度过低会造成试管苗水势过高，导致出现玻璃化现象（于杰等，1989）。在杨树组织培养中，琼脂的浓度一般在5g/L左右。试管苗对营养物质的吸收受到pH的直接影响，从而影响其生长和繁殖。除特殊要求外，一般培养基pH均在5.8～6.0。 　　1.1.3.5温度和光照 　　光环境是由光量、光质、光周期3个因子组成的，它们共同作用影响组培苗的光合作用和生长（张红晓和经剑颖，2003）。张蕾等（2007）研究发现，光照强度对杨树的生长具有一定影响。整体来说，光照强度过低对外植体分化不利，而弱光或全黑会促进愈伤组织分化和根再生，光照强度过高会导致多酚氧化酶活性提高，褐化程度加强。光周期主要由植株的生理特性决定，光照条件不同也会影响愈伤组织的诱导、组织的增殖及器官的分化。 　　不同植物生长的*适温度不同，大多采用25℃±2℃的温度。一般低于15℃时，培养的组织生长出现停滞，而高于30℃对生长也不利，易导致分化芽出现玻璃化现象及褐化程度加重。