泡桐丛枝病发生的表观遗传学

**章绪论 **节植物植原体病害 一、植原体的发现及特征 植原体，原称类菌原体（mycoplasma-like organism，MLO），是日本科学家Doi等（1967）首次发现的，其属于原核生物界柔膜菌纲植原体属，无细胞壁，是由细胞质、核糖体、线状核酸类物质及其外面包被的3单位膜所组成的原核微生物（Bertamini et al.，2003）。其遗传物质为双链DNA；其遗传形式主要以染色质和质粒为主，基因组较小（为530～1350kb），DNA的G+C含量较低（为23%～29%），染色质为环状或者线状。 植原体专一寄生于植物韧皮部细胞，难以人工培养，其传播主要通过以植物韧皮部为食的刺吸式昆虫（飞虱、蚜虫、木虱和叶蝉等）及无性繁殖（如嫁接、扦插或离体繁殖）等（Oshima et al.，2011；宋传生，2014）进行。因介体昆虫与其所传播的植原体之间具有高度特异性，有些植原体可以由多种介体昆虫传播，单种介体昆虫也可以传播多种植原体。据报道，植原体可感染世界范围内98科1000多种植物（Seemüller et al.，1998；Lee et al.，2000），包括粮食作物、林木、蔬菜、果树和花卉等植物，仅中国报道的有关植物植原体病害就有100余种，主要有枣疯病（田国忠等，2002）、泡桐丛枝病（Yue et al.，2008）、苦楝丛枝病（宋传生等，2011）、桑萎缩病（蒯元璋，2012）和莴苣黄化病（Lin et al.，2014），给中国农林业生产造成了巨大的经济损失（刘仲健等，1999；赖帆等，2008）。 二、植原体的分类及检测方法 对于植原体的分类方式，早期主要依据寄主的症状（Kirkpatrick et al.，1987）或者介体昆虫的专一性（Shiomi and Sugiura，1984）等生物学特性进行分类，例如，依据寄主的症状，植原体可以分为衰退、丛枝和变绿三类；依据植原体的特点以及植原体在不同植物上所表现的症状，可将植原体划分为不同的种类。然而，植株矮化、叶片变黄、萎缩等表型特征是由多种因素造成的，不能稳定地表现其病害特点，因此，不能准确地区别植原体的不同种类。此外，由于人工接种工作也比较复杂，基于生物学特性的分类方法在植原体系统分类工作中受到极大的限制。随着分子生物学技术的快速发展，可以依据植原体基因组的16SrRNA序列的保守性和RFLP分析图谱的相似系数，分析不同植原体之间的遗传关系，从而对一些植原体进行分类（Lee et al.，1998），极大地促进了植原体分类的研究。到目前为止，世界范围内已经报道有32种植原体，并且随着环境的变化，一些植原体仍在不断地分化（Lee et al.，2011）。 自从植原体发现至今，其检测方法已经从传统的症状学发展到现代的分子生物学。传统检测植原体的方法主要是依据感染植原体后表现出的症状进行检测。 然而，同一类别的植原体在不同植物，或者同一植物的不同组织、不同发育阶段或不同的生存环境，所表现出的症状都有可能不一样。因此，传统上依据微生物形态或生理表型特征分类方法来检测和鉴定植原体病害及其分类是不可靠的（宋晓斌等，1997）。电子显微镜的应用使人们认识到植原体完整的立体结构，并且也在多种木本植物中检测到植原体的存在（Lee and Davis，1983；陈永萱和叶旭东，1986）。随着分子生物学技术的快速发展，利用抗原抗体免疫反应的血清学可以快速准确地检测植原体存在与否、存在位置和数量（Firrao et al.，2007）。在泡桐、枣树、桑树及梨树等中均检测到了植原体（Chen and Jiang，1988；Jiang et al.，1989；Shen and Lin，1993）。 血清学检测植原体虽然操作简单，但是由于植原体难以人工培养、在寄主内的含量低、易破碎等特点，导致抗原的制备难度较大。而核酸杂交的方法具有较高的灵敏度，特别是对木本植物中植原体的检测。目前，研究人员利用核酸杂交方法分别检测了翠菊黄化病（Kuske et al.，1991）和泡桐丛枝病（Ko and Lin，1994）等病害。但由于一些木本植物中的植原体浓度偏低且纯化困难，该技术的使用范围受到了一定的限制（Kollaretal.，1990）。随着PCR技术的出现，植原体检测的灵敏度得到了大大提升，尤其是巢式PCR、免疫捕获PCR和实时荧光定量PCR的应用，使得植原体的检测更加准确、简洁、快速，并且成功地检测出翠菊黄化、苹果簇生、椰子致死黄化、榆树黄化等植原体（Deng and Hiruki，1991；Lee et al.，1994；Rajan and Clark，1994；廖晓兰等，2002）。 三、植原体病原研究进展 自日本学者Doi等（1967）发现植原体以来，人们对植原体的分类地位进行了大量研究工作。Lee等（1993）和Schneider等（1993）根据植原体16SrDNA基因的限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和全序列对植原体进行了分类，建立了植原体分子分类学的基本框架。Wei等（2007）利用生物信息学方法对植原体的16S rDNA序列进行RFLP分析，将已报道的植原体分类单位增加到28个组、100个亚组。Zhao等（2009）开发出iPhyClassifier在线软件，将植原体分为30个组、100多个亚组。此后，Win和Jung（2012）及万琼莲等（2014）利用植原体16SrDNA基因及核糖体蛋白（ribosomal protein，rp）基因对暂定种Phytoplasma aurantifolia和花生丛枝植原体株系进行了鉴定。植原体基因组DNA包括染色体DNA和染色体外DNA（主要以质粒的形式存在），大小为530～1350kb。基因组DNA中A+T含量较高，G+C含量较低（23%～29%）。科技工作者借助于脉冲电泳使分离的植原体DNA片段大小达到Mb级（Schwartz et al.，1983），有利于植原体基因组学的研究。Neimark和Kirkpatrick（1993）首次从植物中分离出完整的环状植原体染色体，大小为640～1185kb。Firrao等（1996）完成了世界上**张西方X-病植原体（Western X-disease phytoplasma）基因组的物理图谱；随后，人们用PFGE方法、内切酶酶切和Southern杂交技术获得了4个植原体株系染色体的物理图谱：苹果簇生植原体（apple proliferation phytoplasma）（Lauer and Seemüller，2000）、甜薯小叶植原体（sweet potato little leaf phytoplsma）（Padovan et al.，2000）、欧洲核果黄化植原体（European stone fruit yellows phytoplasma）（Marcone and Seemüller，2001）和葡萄金黄化植原体（flavescence dorée phytoplasma）（Malembic-Macheretal.，2008）这5种植原体物理图谱的成功绘制不仅加深了人们对植原体基因组的了解，而且也为植原体基因组序列拼接奠定了基础。近年来，随着DNA测序平台的完善和测序精度的提升，科技工作者已完成了洋葱黄化植原体（OY-M）（Oshima et al.，2004）、翠菊黄化植原体（AY-WB）（Bai et al.，2006）、澳大利亚葡萄黄化植原体（PAa）（Tran-Nguyen et al.，2008）、草莓致死黄化植原体（SLY）（Andersen et al.，2013）、苹果簇生植原体（AT）（Kube et al.，2008）、玉米丛矮病植原体（MBS）（Orlovskis et al.，2016）和枣疯病植原体（JWB）（Wang et al.，2018a）等7种植原体基因组的测序工作，并绘制出了它们的完成图（表1-1）。这些图谱的绘制使人们对植原体病害病原的物理特性、DNA碱基组成、编码蛋白质基因的特点及其依赖寄主生存的方式等有了较为清楚的了解，同时也为植原体致病机理的阐明奠定了坚实基础。 四、植原体致病机理研究 植原体入侵寄主后，病原自身的生长繁殖会引起植物的一系列变化，主要是形态、生理生化、组织和分子水平的变化。 （一）寄主植物的形态变化 植原体入侵引起的植物典型症状有：丛枝、花变叶、花变绿、矮化、黄化、红化、芽和叶片失绿、小叶化、枝条带化等。这些症状可归为丛枝类、黄化类和花器变态类3类。植原体病害发生后，单一寄主植株并不总同时呈现以上3类症状，有的植株出现其中的一类症状，而有的则会同时呈现两类症状，如泡桐丛枝病同时呈现丛枝和花器变态等症状。植物的形态变化因植原体和寄主种类、入侵时间和环境的差异而不同。 （二）寄主植物的生理生化变化 植原体入侵可导致寄主植物内源激素的紊乱、胼胝质积累、叶绿素和光合作用活性降低，氨基酸转运、碳水化合物代谢，以及蛋白质、多胺类物质、酚类化合物及其他次级代谢产物含量的变化。Kesumawati等（2006）和杜绍华等（2013）研究发现，植原体入侵可使植物体内细胞分裂素含量增加，感病植株根部组织中碳水化合物含量降低、代谢能力下降，从而影响植物正常生理代谢活动，导致整个植株发育受阻。植原体入侵寄主植物后可产生多种病症相关蛋白（PR-protein），PR-protein的积累有助于植株总蛋白含量的增加，如抗病系植株的总蛋白量要远高于感病系植株（Junqueira et al.，2004）。酚类物质在病原入侵的植株尤其是病原入侵的抗性植株中大量积累，并且对病原菌有毒害作用，如染病苹果中多酚含量是健康苹果的3倍，李树也有同样的现象（Musetti et al.，2000）。此外，植原体的入侵不仅使植物叶片内叶绿素酶活性升高（Bertamini et al.，2002a），而且使其光合作用相关基因表达水平降低（Bertamini et al.，2002b）。范国强和蒋建平（1997）研究表明，病叶中胱氨酸的含量较健康叶片多，而苯丙氨酸含量则相反，病叶内的碱性氨基酸含量明显低于健康叶片。植原体入侵寄主引起的生理生化变化是植原体病害发生的中下游过程，研究植原体引起寄主体内的这些变化，有利于科技工作者筛选出病害发生生理生化标志物。 （三）寄主植物的组织（细胞）变化 植原体可导致韧皮部组织坏死和筛管内胼胝质的积累（田国忠等，1994a）。泡桐患丛枝病后，枝的顶芽弱化，茎形成层和叶肉中的栅栏组织变薄，次生木质部导管变细，叶脉木质化程度降低，叶背毛刺数量减少（宋晓斌等，1993）。感染桑萎缩病的桑叶及嫩梢中的叶肉细胞，部分细胞核降解、核质部分流失；叶绿体内淀粉粒和嗜锇颗粒有不同程度积累，部分叶绿体外膜破裂、基质流失，有些基粒不规则分散并降解；线粒体及粗面内质网在数量上有不同程度增加但没有叶绿体明显，部分线粒体嵴膨胀并出现降解等现象（徐均焕和冯明光，1998）。这些变化与植原体对寄主植物的危害程度密切相关。 （四）寄主植物在分子水平上的变化 1.寄主植物基因表达的变化 近年来，科技工作者利用高通量测序技术，研究了泡桐、莱檬等患丛枝病前后转录组、非编码RNA（miRNA和lncRNA）、蛋白质组和代谢组的变化情况，从中筛选出了大量与泡桐、莱檬丛枝病发生相关的基因、非编码RNA等（Mardi et al.，2015；Liu et al.，2013；Fan et al.，2014；Cao et al.，2018a；Wang et al.，2018g；Dong et al.，2018b）。但由于筛选出的基因、非编码RNA等数量庞大，很难