生物化学实验教程

**部分基础性实验 实验1氨基酸的分离鉴定——纸层析法 【实验目的】 1. 学习氨基酸纸层析法的基本原理。 2. 掌握氨基酸纸层析法的操作技术。 【实验原理】 纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质氨基酸成分的定性鉴定和定量测定，也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后，在纸层析图谱上的位置可用比移值（rate of flow， Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值： 在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。 【器材与试剂】 1. 器材 层析缸（或标本缸）、点样毛细管（或棉棒）、小烧杯、培养皿、量筒、喉头喷雾器、吹风机（或烘箱）、层析滤纸（新华一号）、直尺及铅笔。 2. 试剂 （1） 扩展剂（水饱和的正丁醇和乙酸混合液)： 将正丁醇、乙酸和水以体积比4∶1∶1混合，充分振荡。 （2） 氨基酸溶液： 0.5%（m/V)组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液（各组分均为0.5%）。 （3） 显色剂： 0.1%（m/V)水合茚三酮正丁醇溶液。 【实验步骤】 图1-1纸层析中的RfRf=XY 1. 准备滤纸 取层析滤纸（长18cm、宽15cm）一张，在纸的一端距边缘2cm处用铅笔画一条直线（图11），在此直线上做5个等距离点。 2. 点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5个位置上，干后重复点样2～3次。每点在纸上扩散的直径不超过3mm。 3. 扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）。待溶剂上升10～12cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机冷风吹干。 4. 显色 用喷雾器均匀喷上0.1%水合茚三酮正丁醇溶液，然后用吹风机热风吹干或者置烘箱中（100℃）烘烤5min即可显出各层析斑点。 5. 计算 用直尺测量并计算出各标准氨基酸的Rf值，同时计算出混合氨基酸的四个层析斑点的Rf值。通过与标准氨基酸比较，确定混合氨基酸中各氨基酸在滤纸上的位置。 【要点提示】 1. 取滤纸前，要将手洗净，因为手上的汗渍会污染滤纸，并尽可能少接触滤纸，如条件许可，也可戴上一次性手套拿滤纸。要将滤纸平放在洁净的纸上，不可放在实验台上，以防止污染。 2. 原点不宜太大，直径应小于3mm，否则分离效果不好，并且样品用量大，会造成“拖尾”现象。 3. 在滤纸的一端用点样器点上样品，原点要高于培养皿中扩展剂液面约1cm。由于各氨基酸在流动相（有机溶剂）和固定相（滤纸吸附的水）的分配系数不同，当扩展剂从滤纸一端向另一端展开时，对样品中各组分进行了连续的抽提，从而使混合物中的各组分分离。 【思考题】 1. 纸层析法的原理是什么？ 2. 何谓Rf？影响Rf的主要因素是什么？ 实验2凝胶层析法使蛋白质脱盐 【实验目的】 学习凝胶层析法分离纯化物质的原理与操作技术。 【实验原理】 凝胶层析也称凝胶过滤，其分离纯化物质的原理是: 凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质被排阻在外部，当一混合溶液通过凝胶层析柱时，溶液中的物质就按不同相对分子质量被分开了。凝胶层析过程中一般不变换洗脱液，具有设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等优点。所以，此法除了常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质外，还可用于测定蛋白质的分子质量、样品的浓缩和脱盐等方面。目前常用的凝胶包括葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，其中*常用的是葡聚糖凝胶。 葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，它是葡萄糖通过α1，6糖苷键形成的葡聚糖长链，与交联剂环氧氯丙烷以醚键相互交联而成的，具有三维空间的多孔网状结构物（图12），呈珠状颗粒。 图1-2葡聚糖凝胶的多孔网状结构示意图 在合成凝胶时，控制环氧氯丙烷的用量，可以制成网孔大小不同的葡聚糖凝胶，即不同规格的凝胶。葡聚糖凝胶从G10到G200有多种类型。G后的数字代表每克干胶充分溶胀后吸水的克数乘以10，也反映了凝胶网孔的相对大小，G后的数字越小，其溶胀后的网孔越小。一般G10到G50适用于蛋白质与小分子或无机盐的分离，G75到G200适用于相对分子质量大于10000Da的蛋白质的相互分离。 蛋白质溶液中如含有无机盐离子，用葡聚糖凝胶层析法可使蛋白质与无机盐分离，效果理想。本实验用G25凝胶使蛋白质与（NH4)2SO4分离，当蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的（NH4)2SO4扩散进入G25的网孔中，而大分子的蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻在凝胶颗粒（固定相）的外面。加入洗脱液（流动相）洗脱时，因大分子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动，首先被洗脱下来，而小分子的（NH4)2SO４可以扩散进凝胶颗粒的网孔之中，在层析柱中移动较慢，需要较大的洗脱体积才能从柱中洗出，这样蛋白质与（NH4)2SO4很容易地被分离开，从而达到使蛋白质样品脱盐的目的（图13）。 图1-3凝胶层析法原理示意图 （a) 蛋白质混合物上柱； （b) 样品上柱后，小分子进入网孔，大分子不能进入，故先洗脱下来； （c) 小分子后洗脱下来 【器材与试剂】 1. 器材 铁架台、层析柱（11mm×300mm）、滴定管夹、1mL刻度滴管、刻度试管、白瓷板、Sephadex G25（粒度粗50～100目）、细乳胶管、螺旋夹、弹簧夹、烧杯。 2. 试剂 （1) 10％（m/V)磺基水杨酸溶液。 （2） 奈斯勒（Nessler）试剂： 通常称为奈氏试剂，将HgI2 11.5g、KI 8g溶于去离子水中，稀释至50mL，加入6mol/Ｌ NaOH 50mL，静止后取上清液储存于棕色瓶中。 （3） 蛋白质（NH4)2SO4溶液： 实验前配制含0.25％（m/V)牛血清清蛋白、0.1％（m/V)（NH4)2SO4和10%（m/V)蔗糖的混合溶液。 （4） 去离子水（洗脱液）。 【实验步骤】 1. 溶胀凝胶 用去离子水浸泡Sephadex G25 24h以上（中间换一次水），或用去离子水沸水浴溶胀2h左右。 2. 凝胶装柱 将层析柱固定在铁架台上，两端分别连接乳胶管。上端与洗脱液连通，装一螺旋夹用于调控洗脱速度。先用少量洗脱液洗柱并排出乳胶管中的气泡，待柱中洗脱液高度约2cm时，关闭下端开关式弹簧夹。 将溶胀好的Sephadex G25倒入层析柱中，使其自然沉降，沉降后凝胶柱的高度为层析柱的3/4～4/5且柱床面平整度比较理想。打开下端开口，排除多余的洗脱液，床面上维持约2cm高的洗脱液，再关闭下口。 3. 洗柱 通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层析柱接通，然后打开下端开口，让洗脱液滴下冲洗层析柱，以除去杂质并使柱床均匀密实（此步也称作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般为柱床体积的2～3倍），再关闭下口。洗柱过程中注意调整流速约2mL/min。 4. 加样洗脱 用刻度滴管吸取1mL样品［蛋白质（NH4)2SO4溶液］，其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间有一清晰界面。打开下端开口，待样品全部进入凝胶柱中，接通洗脱液，开始洗脱并收集洗脱液。