基因操作技术

绪论
【学习目标】1
一、基因操作技术的基本概念1
二、基因操作技术的过程和内容2
三、基因工程的诞生与发展3
四、基因工程的应用6

项目一计算机模拟构建重组载体
【学习目标】10
【项目简介】10
【项目引导】10
一、核酸数据库11
二、 UniProt蛋白质数据库11
【项目实施】14
任务一数据库中查找SARS-CoV-2 N基因序列14
任务二SnapGene模拟构建pET28a（+）-N重组载体15
【复盘提升】20
【项目拓展】20
一、生物信息学20
二、序列比对与BLAST21

项目二总DNA的提取和检测
【学习目标】23
【项目简介】23
一、CTAB法提取植物细胞染色体DNA23
二、SDS法抽提总DNA24
【项目引导】24
一、核酸的分子组成24
二、DNA的结构24
三、核酸浓度的测定方法26
四、凝胶电泳技术28
五、核酸的保存31
【项目实施】32
任务一SDS法提取细菌总DNA32
任务二紫外分光光度计测定总DNA浓度33
任务三琼脂糖凝胶电泳检测总DNA33
【复盘提升】34
【拓展知识】34
一、样品的采集和保存34
二、酚氯仿法提取全血DNA35
三、CTAB法提取植物DNA37

项目三质粒的提取及检测
【学习目标】38
【项目简介】38
【项目引导】40
一、载体40
二、质粒载体40
三、质粒载体的种类41
四、标记基因44
【项目实施】47
任务一碱裂解法提取大肠杆菌质粒47
任务二紫外分光光度计测定质粒浓度47
任务三琼脂糖凝胶电泳检测质粒47
【复盘提升】48
【项目拓展】48
一、乳糖操纵子48
二、常用大肠杆菌表达载体49

项目四mRNA提取和cDNA制备
【学习目标】56
【项目简介】56
【项目引导】57
一、RNA概述57
二、RNA的种类和功能57
三、RNA的结构与功能58
四、RNA的生物合成与加工61
五、RNA提取方法61
【项目实施】62
任务一Trizol法提取动植物总RNA63
任务二变性琼脂糖凝胶检测总RNA63
任务三mRNA提取64
任务四cDNA合成技术65
【复盘提升】66
【项目拓展】66
一、植物病毒RNA提取66
二、cDNA的制备66

项目五体外扩增目的基因
【学习目标】71
【项目简介】71
【项目引导】71
一、DNA的生物合成71
二、PCR的原理73
三、DNA聚合酶75
四、PCR引物设计76
五、PCR反应体系77
【项目实施】78
任务一引物设计78
任务二模板DNA提取81
任务三PCR扩增目的片段81
任务四琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物82
任务五回收PCR产物82
【复盘提升】83
【项目拓展】83
一、RT-PCR83
二、PCR技术的应用84
三、DNA人工合成技术85

项目六构建含有外源基因的重组载体
【学习目标】87
【项目简介】87
【项目引导】88
一、工具酶88
二、提高重组率的方法94
【项目实施】94
任务一DNA片段和质粒的双酶切94
任务二酶切产物的胶回收96
任务三DNA片段和载体DNA的连接96
【复盘提升】97
【项目拓展】97
一、cDNA末端快速扩增技术97
二、一步法克隆100

项目七重组载体转化大肠杆菌
【学习目标】103
【项目简介】103
【项目引导】104
一、感受态细胞104
二、转化方法104
三、重组子的筛选策略105
【项目实施】106
任务一E.coli感受态细胞的制备107
任务二热激法转化E.coli107
任务三转化子的筛选——菌落PCR107
任务四转化子的鉴定——酶切验证108
任务五转化子的鉴定——测序及比对108
【复盘提升】110
【项目拓展】110
一、常用表达宿主110
二、动植物细胞的转化113
三、DNA测序115
四、CRISPR-Cas9116

项目八目的基因在大肠杆菌中的表达及纯化
【学习目标】119
【项目简介】119
【项目引导】120
一、翻译120
二、Ni-亲和色谱法纯化融合蛋白121
三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳122
【项目实施】124
任务一目的基因在大肠杆菌中的诱导表达124
任务二可溶性重组蛋白质的提取125
任务三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定目的蛋白126
任务四重组蛋白质缓冲液的置换及保藏128
任务五重组蛋白质浓度测定128
【复盘提升】129
【项目拓展】129
一、包涵体的提取129
二、影响外源基因的高效表达的因素132
三、蛋白质印迹法133
四、蛋白质序列测定135

项目九综合性生产实训——以新型冠状病毒核衣壳蛋白的表达为例
【学习目标】137
【项目简介】137
【项目引导】138
一、接单评估138
二、方案设计138
三、项目执行138
四、产品交付139
【项目实施】139
【产品交付】144
一、产品综合报告144
二、交货单144

附录
一、常用仪器设备及使用146
二、基因操作技术常用溶液的配制152
三、常用核酸蛋白质换算数据156

参考文献