动物医学实验技术——基础兽医学

**章 动物实验基本操作技术及规范 动物实验是动物医学专业实践课程必不可少的环节，而实验动物是动物实验的重要支撑和保障，二者还广泛应用于生物学、医学、药学、畜牧学等学科。 一、实验动物 广义上讲，实验动物是指经人工培育的、专门供实验研究使用的动物。但为了实验结果的可靠，对实验动物的要求相对严格。因此，狭义的实验动物是指经过人工培育、遗传背景清楚、对其微生物和寄生虫进行控制，用于科学研究、教学及药品和生物制品安全性评价的动物。 动物实验是指以实验研究为目的，在动物福利得到保障的前提下，对实验动物进行各种处理，以获得新的、科学的实验数据的过程。 实验动物按遗传学可分为：①近交系实验动物，即纯系实验动物，指动物间连续兄妹交配，或相当于兄妹交配20代以上培育的动物品系；②封闭群实验动物，即一个种群动物位于固定地点，5年以上不从外部引进任何新种，仅在群内随机交配繁殖，该动物可来源于近交系或非近交系，能保持群体一般特性，且易大量繁殖；③杂交一代（F1）实验动物，指两个不同近交系杂交产生的**代动物。 实验动物按微生物控制程度可分为：一级，普通动物；二级，清洁动物；三级，无特定病原体动物，即SPF动物；四级，无菌动物，即GF动物。 二、实验用动物 实验用动物是指所有可用于动物实验的动物。人类进化的历史，也是人类对动物驯化的历史，人类使用动物进行实验研究历史较久。早期没有专门培育的实验动物，往往使用驯养的家畜、家禽等开展实验，直至20世纪初才开始繁育专门用于动物实验的实验动物。目前真正经过人工培育的实验动物仅100多种，远远无法满足科学研究的需要，必须采用其他动物进行实验研究，甚至较多的科学研究对象本身就是生活在自然界的野生动物。因此，实验用动物范围更大，主要包括人工培育的实验动物、家畜、家禽和野生动物。 动物实验的基本技术包括实验动物的捉取和保定、个体标记技术、被毛的去除方法、麻醉、给药技术、血液采集和制备技术，以及动物伦理、动物福利和实验动物的安乐死等。 **节 常用实验动物 实验动物具有生物学特性明确、遗传背景清楚、表型均一、对刺激敏感性和反应性一致的特点。这些特点有利于人们进行实验时获得精确、可靠的结果，并且使实验具有良好的可重复性，因而广泛用于生物医学研究。动物实验中常用的实验动物如下。 一、青蛙和蟾蜍 二者均属于两栖纲无尾目，青蛙属蛙科，蟾蜍属蟾蜍科。品种很多，是脊椎动物由水生向陆生过渡的中间类型。蟾蜍较大，皮肤粗糙，表面有许多突起，眼的后方有一对毒腺，所分泌的黏液为蟾酥。青蛙和蟾蜍的心脏主要由一个心室、左右两个心房、动脉圆锥和静脉窦组成。静脉窦是青蛙和蟾蜍心脏的正常起搏点，损伤时将引起心率减缓甚至停跳。心脏的动脉圆锥向前延续成为动脉干（主动脉），然后立即向左右分成3对动脉弓：颈总动脉弓、主动脉弓和肺皮动脉弓。 青蛙和蟾蜍的心脏在离体情况下仍有很久的节律性搏动，可用于心脏功能方面的实验研究，如离体心脏灌流、心肌兴奋性及收缩、心电图等。蛙舌和肠系膜是观察炎症及微循环变化的良好标本。利用蛙下肢血管灌注方法可进行水肿和各种因素对血管作用的实验。用蟾蜍后肢制作坐骨神经-腓肠肌、坐骨神经-缝匠肌标本，在生理学实验中常用于神经、肌肉兴奋性的观察。此外，还可用于脊髓休克、脊髓反射、谢切诺夫抑制、反射弧的分析等方面的实验。 二、家兔 家兔属于哺乳纲兔形目兔科，是草食动物，寿命为4～9年。品种甚多，全世界有6属50余种。*常用的品种有：①中国本兔（白家兔），毛色多为纯白，红眼睛，是我国长期培育的一个品种，成年兔重1.5～3.5kg。②青紫蓝兔（山羊青兔或金吉拉兔），毛色银灰色，成年兔重2.3～3.5kg。③大耳白兔（日本大耳白兔），毛色纯白，红眼睛，两耳长大，血管清晰，便于静脉注射和采血，成年兔重4～6kg。 家兔颈部有单独的降压神经分支，在人和其他哺乳动物中，此神经不单独分离。学生实验中常涉及的神经有3对：迷走神经（*粗）、交感神经（较细）、降压神经（又称为缓冲神经，三者之中*细，位于迷走神经和交感神经之间）。学生实验中常涉及的血管为颈总动脉，这条动脉在进入颅腔前分为颈内动脉和颈外动脉，在分支处的血管壁上存在压力感受器——颈动脉窦和化学感受器——颈动脉体。两侧的颈总动脉分别与两侧的三条神经由膜包被形成颈总动脉鞘。 家兔易于繁殖和饲养，性情温顺，灌胃、取血方便。由于兔耳缘静脉浅表，易暴露，因此是静脉给药的*佳部位。家兔颈部降压神经与迷走神经分离、自成一束，常用于心血管反射活动（是研究降压反射的首选动物）、呼吸运动、泌尿功能调节的研究。另外，卵巢、胰岛等可用于内分泌实验。离体兔耳和离体兔心常被选作灌流实验的标本，进行心血管方面的分析性研究。在心肌细胞电生理学的研究中，兔心的窦房结常用来进行心脏起搏电位的研究。 需要注意的是，家兔心血管系统较为脆弱，有时会出现反射性衰竭。家兔的大脑皮层运动区经定位已具有一定的雏形，因此家兔也常用于大脑皮层机能定位和去大脑僵直、神经放电等实验。家兔的消化管运动活跃，可用于消化管运动及平滑肌的研究。另外，家兔缺乏呕吐反射与咳嗽反射，故研究此类问题时，不宜选用。 三、小鼠 小鼠属于哺乳纲啮齿目鼠科。小鼠温顺易捉，操作方便，对多种病原体易感，实验的准确性和一致性较高，是医学实验中用途*广泛和*常用的动物，广泛用于药理学（药物筛选实验、生物药效学实验、半数致死量或半数有效量的测定）、毒理学、生殖生理学和肿瘤学等学科。 四、大鼠 大鼠属于哺乳纲啮齿目鼠科，具有小鼠其他方面的优点，但性情不如小鼠温顺，受惊时表现凶恶，易咬人，雄鼠间常发生殴斗和咬伤。大鼠可用于胃酸分泌、胃排空、水肿、炎症、休克、败血症、心功能不全、肾功能不全等实验。 五、豚鼠 豚鼠属于哺乳纲啮齿目豚鼠科，又称为天竺鼠、荷兰猪。其性情温顺、胆小，不咬人，喜欢生活在清洁安静的环境中。豚鼠耳蜗管发达，听觉灵敏，在生理学上常用于耳蜗微音器的实验，也用于临床听力的实验研究。此外，还用于离体心房和心脏实验、钾代谢紊乱、酸碱代谢紊乱、肺水肿等实验，也用于离体肠、子宫平滑肌、心肌细胞电生理特性等实验。豚鼠对结核分枝杆菌敏感，是用于抗结核病药物实验的常用动物。 六、犬 犬属于哺乳纲食肉目犬科。犬听觉、嗅觉灵敏，反应敏捷，易饲养，可调教，对外界环境的适应能力强，对手术的耐受性较强。犬具有发达的血液循环与神经系统，内脏构造及其比例与人相似，因而犬广泛适用于许多系统的急性、慢性实验研究，是较理想的实验动物。在生理学研究中常用于心血管系统、脊髓传导、大脑皮层机能定位、条件反射、内分泌腺摘除和各种消化系统机能的实验研究。犬还用于药理学、毒理学、行为学、肿瘤学、核医学及临床某些疾病的研究。 七、羊 羊属于哺乳纲偶蹄目牛科羊亚科。羊喜粗食，易饲养，性格温顺，具有复胃，颈静脉表浅，多用于采血、心电图、复胃消化生理及其内的微生物观察等。 八、猪 猪属于哺乳纲偶蹄目猪科。猪嗅觉灵敏，对外界环境适应能力强，常用于巴氏小胃、血液循环系统及病理、药理实验。猪在解剖学、生理学、疾病发生机制等方面与人极为相似，因此在生理科学领域中的应用率越来越高。 第二节 实验动物的捉取和保定 实验动物的捉取和保定是所有动物实验操作中*基本的技术，是进行各种动物实验的前提。不同种类动物的捉取和保定方法差别较大，即便同种动物，其捉取和保定方法也存在差异。此外，不同实验者的操作习惯也存在差异。但无论采用何种捉取和保定方法，都应遵循基本原则：做好个人安全与防护，防止对动物造成人为损伤，禁止粗暴对待动物。 由于多数实验动物对非条件性的各种刺激会产生防御性反抗。因此，在捉取和保定前应对动物的生活习性有所了解，并采用合适的捉取和保定方法，防范动物的攻击和逃脱。通常在捉取和保定实验动物过程中首先要缓慢、友好地接近动物，同时注意观察其反应，让动物逐渐适应。捉取时的动作力求迅速、准确、熟练，在动物感到不安之前捉取到它们。 一般实验时间较短和无特殊保定要求的实验操作，可采取徒手保定。如进行较长时间的实验或对动物实验有特殊的体位保定要求时，可使用专门的保定器械。 一、常用的保定器械 1．大鼠、小鼠固定器多呈一端封闭的圆筒状，根据实验目的和动物的个体大小选用合适规格和种类，一般将大鼠或小鼠放在固定器打开的开口处，其会自行钻入固定器，关闭入口，使其不能退出即达到保定目的。此时动物呈蜷伏姿势，尾部露出，常用于尾侧静脉注射、采血等操作。 无专用固定器时，可借助实验室现有器械，如借助大烧杯倒置将小鼠扣在烧杯内，尾巴可整条露出烧杯外。 2．兔固定盒兔固定盒可将家兔的头部和尾部露出，此种保定常用于兔耳缘静脉注射、体温测定等操作。无专用的兔固定盒时，可先将家兔捉取后使其蜷伏于桌面，采用软布包裹兔身，也有较好的保定效果。 3．犬保定器材驯服犬能够听从主人的指挥，可由犬主唤来而无须捉取，如要捉取，可先从侧面靠近犬并抚摸其颈背部皮毛，用手将其抱住。未经驯服、调教的犬在捉取时可使用长柄环状铁钳固定住犬的颈部或用长柄铁钩钩住颈部的项圈控制住犬。 保定犬时可使用专用的犬口罩或用束带束缚犬嘴。犬口罩通常由金属网、皮革或棉麻等材料制成。驯服犬还可采用悬吊式保定架进行保定。在此种保定下可进行体检、灌胃、采血、注射等常规操作。 4．动物麻醉状态下的保定器械麻醉后保定主要用于各种手术操作，保定时要求充分暴露手术部位，保定器械通常由手术台面及相应的用于固定四肢、头部或躯体其他部位的附件组成。将动物麻醉后，以细绳、胶布或橡皮筋将四肢牵引展开并保定于手术台相应附件处，可以采取俯卧、仰卧、侧卧等体位保定，必要时以门齿牵引钩或牵引绳扣住上门齿或用类似部件对头部进行保定。 二、常见动物的捉取和保定技术 1．两栖动物的捉取和保定常见的用于动物实验的两栖动物有青蛙、蟾蜍和牛蛙。青蛙和蟾蜍个体较小，可单手捉取和保定，牛蛙个体较大，捉取和保定时常双手进行操作。 （1）捉取方法捉取青蛙和蟾蜍时，可以左手手掌紧贴其背部，以中指、无名指、小指压住其左腹侧和后肢，拇指和食指分别压在左、右前肢，以右手进行操作。捉取蟾蜍时，注意不要挤压其两侧耳部突起的毒腺，以免毒液喷出。 （2）保定方法如实验时间较长，可用大头针将其保定在蛙板上。依实验需要采取俯卧位或仰卧位。 2．小鼠的捉取与保定 （1）捉取方法徒手从鼠笼中将小鼠尾中部或基部抓住后取出（不可抓尾尖），也可用镊子夹住小鼠的尾巴提起。 （2）保定方法 1）徒手保定：右手捉住小鼠尾，将小鼠放于表面粗糙的物体上，操作熟练者可将小鼠放于实验台上，向后轻拉鼠尾。当其向前挣扎时，左手拇指和食指抓住小鼠两耳和颈部皮肤，无名指、小指和手掌心夹住其背部皮肤和尾部，并调整小鼠在手中的姿势。此方法多用于肌内、腹腔和皮下注射及灌胃等实验。 2）固定板保定：将小鼠麻醉后置于固定板上，仰卧位，先用胶布缠绕四肢，再用针将胶布扎在固定板上进行保定。此方法常用于心脏采血、解剖、外科手术等实验。小鼠固定板可自制，取一块边长15～20cm的木板（三合板或五合板*佳），板前方边缘钉1根钉子，用于固定其头部，小鼠上腭切齿上牵一根线。在板左右边缘各扎入2根针或钉入2根钉子。消毒后备用。 3）固定器保定：让小鼠直接钻入固定器内并关闭入口，露出尾巴。 3．大鼠的捉取和保定 （1）捉取方法大鼠体重较小（＜200g）时，可抓住大鼠尾根将其提起，也可抓其颈背部皮肤将其提起。大鼠体重较大（＞200g）时，须一手抓鼠尾，一手抓颈背部皮肤，防止大鼠身体局部受力过重而发生损伤。个别大鼠