生物化学与分子生物学实验教程(第2版)

**篇基础性实验 经过长期实验教学实践证明，这一部分收录的10个基础性实验有利于巩固学生的生物化学与分子生物学基本理论知识，有助于培养学生的基本实验操作技能。根据医学生物化学与分子生物学教学的逻辑和规律，实验教学内容按物质分类编排，实验1~实验3是有关蛋白质定性、定量检测与分离技术，实验4~实验5是关于血液生化指标检测，实验6~实验7是酶学相关实验，实验8~实验10则涉及DNA提取与基因扩增技术。这些基础性实验几乎涉及了大部分生物化学与分子生物学的基本技术，例如分光技术、电泳技术、离心技术以及PCR技术等，是医科院校本科实验教学的重要组成部分。 实验1　蛋白质的呈色反应、沉淀现象观察及等电点的测定 【实验目的】 1．能够阐述蛋白质等电点的概念、盐析法沉淀蛋白质的基本原理。 2．能够利用沉淀现象分析引起蛋白质沉淀的因素。 【实验原理】 将尿素加热至180 ℃左右，两分子尿素脱去一分子氨缩合成双缩脲，在碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜结合，生成紫色或紫红色的复合物，此即双缩脲反应。凡含有两个以上肽键的化合物，都能发生双缩脲反应，故一切蛋白质及二肽以上的物质都有此反应。 凡是含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、各种氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸除外）以及其他伯胺化合物（包括氨），与茚三酮的水合物共热时，可生成紫蓝色的化合物。 维持蛋白质胶体溶液稳定的因素主要是同种电荷和水化膜。当这两个因素遭破坏后，蛋白质分子颗粒就发生聚集并析出沉淀。能使蛋白质沉淀的化学试剂主要有：中性盐类、某些有机溶剂、重金属盐类及生物碱试剂等。向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐时，蛋白质从溶液中沉淀析出，此即为是盐析。 蛋白质分子在酸性或碱性环境中，带有正电荷或负电荷，互相排斥，不易形成沉淀，在等电点时，由于失去同种电荷相互排斥的作用，很容易形成沉淀。体内各种蛋白质的等电点不同，但大多数蛋白质的等电点接近于pH 5.0。 蛋白质分子在大于等电点的pH溶液中，与带有正电荷的重金属离子结合，即形成不再溶解的沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质，能引起蛋白质变性，而中性盐类即使加入量很多也不改变蛋白质原有的性质。 生物碱是植物中具有显著生理作用的一类含氮的碱性有机物质。凡能够使生物碱沉淀，或能与生物碱作用而呈色的物质，称为生物碱试剂，主要有：磷钨酸、苦味酸、鞣酸等。蛋白质在小于等电点的 pH溶液中，能与生物碱试剂中的负离子结合而形成沉淀，此沉淀通常可在碱性溶液中再溶解。蛋白质能与沉淀生物碱的试剂作用而产生沉淀，可能是由于蛋白质含有与生物碱相似的含氮基团。 所有蛋白质都可因为高温加热破坏了其分子内部的化学键而变性、凝固。溶液中的蛋白质在过酸或过碱环境中容易变性，此时若温度升高，蛋白质虽变性但不产生沉淀，冷却后，调节溶液的pH到等电点时，则有沉淀析出。 【实验器材与试剂】 1．实验器材 移液器、电炉或电磁炉、恒温水浴箱、滤纸、Φ50 mm 漏斗、10 mL量杯、刻度吸量管。 2．试剂 10%卵清蛋白溶液、10%NaOH溶液、10%HCl溶液、1%CuSO4溶液、尿素、0.1%茚三酮乙醇液、0.25%丙氨酸溶液、0.5%NaOH溶液、0.5%ZnSO4溶液、饱和（NH4）2SO4溶液、10%磺基水杨酸溶液、1%乙酸溶液、10%乙酸溶液、0.5%酪蛋白的乙酸钠溶液（称取纯酪蛋白0.5 g，置于100 mL容量瓶内，加蒸馏水40 mL、1 mol/L NaOH溶液10 mL后摇匀，使酪蛋白溶解后再加入1 mol/L乙酸10 mL，*后用蒸馏水稀释至刻度）。 【实验步骤】 1．蛋白质的呈色反应 （1）双缩脲反应 ①取试管1支，加入10%卵清蛋白溶液0.1 mL、10%NaOH溶液0.25 mL及1%CuSO4溶液0.1 mL，混匀后，观察试管中的溶液呈现出什么现象？记录并解释。 ②另取试管1支，加入尿素0.5 g，加热使尿素熔化，此时可嗅到什么气味？继续加热使之凝固，该固体为何物？加入蒸馏水2 mL使固体溶解，再加入10%NaOH溶液0.25 mL、1%CuSO4溶液0.1 mL，试管中的溶液呈现出什么现象？记录并解释。 （2）茚三酮反应 ①取试管1支，加入10%卵清蛋白溶液0.2 mL、蒸馏水0.5 mL及0.1%茚三酮乙醇液0.3 mL，混匀后置于沸水浴中加热，1 min后取出。观察试管中溶液呈现出什么颜色，冷却后有何变化？ ②另取试管1支，加入0.25%丙氨酸溶液0.2 mL、蒸馏水0.5 mL及0.1%茚三酮乙醇液0.3 mL，混匀后置于沸水浴中加热，1 min后取出。观察试管中溶液呈现出什么颜色，冷却以后有何变化？ 2．蛋白质的沉淀反应 （1）蛋白质的盐析 ①取试管1支，加入10%卵清蛋白溶液5 mL、饱和（NH4）2SO4溶液5 mL，混匀，静置20 min后则球蛋白全部析出沉淀。将静置后的液体过滤，收集过滤后的透明液（滤液中含有清蛋白）。若滤液浑浊须重复过滤至透明为止。 ②另取试管1支，加入上述清滤液1 mL、固体（NH4）2SO4 0.5 g，摇动试管至溶液出现混浊。再向浑浊溶液［不含（NH4）2SO4结晶颗粒］中加入蒸馏水2.0 mL，摇匀，记录结果并解释。 （2）重金属盐类沉淀蛋白质　取试管1支，加入10%卵清蛋白溶液1 mL和0.5%NaOH溶液50 μL，混匀。再加入0.5%ZnSO4溶液0.3 mL，记录结果并解释。 （3）生物碱试剂沉淀蛋白质 ①取试管1支，加入10%卵清蛋白溶液1 mL、10%HCl溶液50 μL，混匀。再加入10%磺基水杨酸溶液0.2 mL，混匀，记录结果。 ②另取试管1支，加入10%卵清蛋白溶液1 mL、10%NaOH溶液0.3 mL，混匀。再加入10%磺基水杨酸溶液0.2 mL，混匀，记录结果。 ③比较两支试管中溶液的变化，并解释原因。 （4）加热沉淀蛋白质 ①取试管4支，编号后按表1-1加入试剂： 表1-1　加热沉淀蛋白质反应体系配制 ②将4支试管同时放入沸水浴中，1 min后取出，记录现象，并解释原因。 ③冷却后，向第3支试管中缓慢加入10%NaOH溶液，每次30 μL，边加边摇动试管，观察现象并记录所加NaOH溶液的量。 ④向第4支试管中缓慢加入10%乙酸溶液，每次0.2 mL，边加边摇动试管，观察现象并记录所加乙酸溶液的量。 3．蛋白质等电点的测定 （1）取直径相同的试管5支，编号后按表1-2准确加入试剂。 表1-2　蛋白质等电点测定的反应体系配制 （2）向各管中加入酪蛋白的乙酸钠溶液l mL，边加边摇（切勿在各管都加完后才摇），静置10~30 min后，分别比较各管的浑浊度，并用（＋）符号表示。沉淀*多而上清液透明管的溶液pH即为酪蛋白的等电点。记录其等电点。 【注意事项】 等电点的测定时，在向各管中加入酪蛋白的乙酸钠溶液l mL时，边加边摇，切勿在各管都加完后才摇动试管。静置后观察浑浊度时，不能摇晃试管。 【思考题】 1．什么是蛋白质的两性解离及等电点？引起蛋白质沉淀的主要因素有哪些？ 2．是不是只要发生双缩脲反应就一定有蛋白质存在？氨基酸能不能发生双缩脲反应？ （吴冠儒） 实验2　蛋白质含量的测定 蛋白质含量的测定方法很多，各有优缺点，本实验主要介绍了双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、紫外法的相关实验操作。 【实验目的】 1．能够阐述双缩脲法、考马斯亮蓝染色法及紫外法测定蛋白质的原理。 2．能够独立完成蛋白质定量测定的实验操作。 一、双缩脲法测定血清蛋白质含量 【实验原理】 两分子脲经180 ℃左右加热，释放出一分子氨后，得到双缩脲（NH3CONHCONH3）。在强碱性条件下，双缩脲与Cu2＋生成紫红色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基，或两个及以上肽键的化合物，都能进行双缩脲反应。紫红色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子质量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。 本实验将血清中的总蛋白质，经双缩脲试剂显色后，再通过比色测定其含量。 本法测定范围为1~10 mg蛋白质，优点是快速、干扰物质少，且不同蛋白质显色相似，缺点是灵敏度差，适用于精度要求不高但需快速测定的样本。 【实验器材与试剂】 1．实验器材 刻度吸量管、洗耳球、试管、可见分光光度计。 2．试剂 （1）稀释血清：取1 mL血清（人、兔或其他蛋白样品），置于100 mL容量瓶中，加0.9%NaCl溶液稀释至刻度（此为稀释100倍，或根据具体情况酌情稀释100~300倍）。 （2）双缩脲试剂（碱性铜试剂）：称取1.75 g硫酸铜（CuSO4 5H2O）置于1000 mL烧杯中，先加蒸馏水使之溶解，将此溶液移至1000 mL容量瓶中。再加入300 mL浓氨水和200 mL饱和NaOH溶液混匀，以蒸馏水加至1000 mL，置于塑料瓶中避光长期保存，但有沉淀或无氨水气味则不能再用。 （3）标准蛋白溶液（1 mg/mL）：牛血清白蛋白用 0.9%NaCl溶液溶解、稀释至终浓度 1 mg/mL，存于冰箱中，可保存一个月。此标准蛋白溶液用以绘制标准曲线及在测定时用作标准对照。 【实验步骤】 1．标准曲线的绘制 取试管6支，按表2-1操作。