细菌纤维素生物材料

第1章 细菌纤维素的结构、性质与生物合成 1.1 细菌纤维素的化学结构和性质 细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）是一类由微生物合成的胞外多糖类高分子，于1886年首次由英国科学家Brown[1]发现。在静置培养木驹形氏杆菌（Komagataeibacter xylinus，曾命名为木葡糖醋杆菌Gluconacetobacter xylinus、木醋杆菌Acetobacter xylinum）时，Brown发现在培养基的表面形成了一层白色凝胶状的薄膜物质，经过化学分析后确定其成分为纤维素，因其主要由细菌合成而被命名为细菌纤维素。与植物纤维素不同，细菌纤维素不含半纤维素和木质素等成分，是一种纯纤维素，进一步研究发现该纤维素的直径为纳米级。此后，细菌纤维素的化学结构及其性质不断地被科学家探索和研究，其性能和应用也不断地被开发和挖掘。 1.1.1 细菌纤维素的化学结构及构象 BC是以D-吡喃葡萄糖环为基本结构单元，并通过β-1， 4-糖苷键相互连接键合成的直链高聚糖，直链间彼此平行，不呈螺旋构象，无分支结构，又称为β-1， 4-葡聚糖。BC的纤维素链上，每个葡萄糖结构单元都具有三个活性羟基，伯羟基位于结构单元的C6位上，而另外两个仲羟基则依次分布在葡萄糖环的C2和C3位上[2]，纤维素链的结构式如图1-1所示。 细胞产生的纤维素结构与其合成过程紧密相关：自然界中，细胞膜上纤维素合成位点的分布对相应的纤维素Ⅰ型中葡聚糖的聚集有至关重要的影响[3]；尽管在一般情况下，细胞合成的纤维素为Ⅰ型，但性质更稳定的却是纤维素Ⅱ型。 纤维素Ⅰ型的晶胞结构为单斜晶，具有3条不同长度的轴和一个非90°的夹角，其分子链中存在着大量的羟基，因此容易形成很强的分子内和分子间氢键，纤维素链上所有的羟基都在氢键之中。纤维素Ⅰ型晶胞的两个方向上存在着氢键网络：①在沿分子链（角链和中心链都涵盖在内）方向上存在分子内氢键，且该氢键分布于纤维素链的两侧；②在每个葡萄糖残基沿轴方向与相邻的纤维素分子链之间形成分子间氢键，该氢键键合的链片平行于α轴，而链片间和纤维素晶胞对角线上并无氢键存在，该结构的稳定靠范德瓦耳斯力来维持。 图1-1 （a）纤维素链的结构式；（b）纤维素的哈沃斯（Haworth）投影式结构式[2] 纤维素Ⅱ型是一种葡萄糖以反向平行排列的葡聚糖，形成了一种反平行链的结构，是纤维素Ⅰ型的一种结晶变体。纤维素Ⅱ型一般不由细胞合成，而是由纤维素Ⅰ型经化学处理后得到，处理方法主要包括丝光处理和溶解再生等。与纤维素Ⅰ型相比，Ⅱ型的氢键网络更为复杂：纤维素Ⅰ型和Ⅱ型*主要的区别在于角链（向上）与相邻中心链（向下）间形成的这一附加分子间氢键；除此之外，由于纤维素Ⅱ型氢键的平均长度（0.272 nm）比Ⅰ型（氢键平均长度0.280 nm）短，因此其堆砌更为紧密，所以在热力学上，反平行链结构的纤维素Ⅱ型比Ⅰ型更为稳定。 利用红外光谱对BC的化学结构组成进行分析，发现在1158 cm-1处存在纤维素中糖苷键的特征峰，在895 cm-1以及1427 cm-1处存在纤维素的C—H和C—H2键的弯曲振动峰；除此以外，谱图中在3350 cm-1处出现的峰对应于纤维素O—H的伸缩振动峰，而在2900 cm-1处则出现纤维素的C—H伸缩振动峰[4]。 BC的纤维素分子链末端基的化学性质是不同的，其中一端的C不具有还原性，而另一端的C上的羟基会在葡萄糖环开链时形成醛基，使其具有还原性[5]。为了保持更低的能量组成以及维持自身结构的稳定，纤维素的D-吡喃葡萄糖环单元为椅型构象（chair conformation）而不是船型构象（boat conformation）[6]。除此之外，BC的结构单元不仅呈现椅式扭转，且其在C2位、C3位以及C6位上的羟基也均处于同一水平位置。 1.1.2 细菌纤维素的化学性质 1.细菌纤维素的高化学纯度 纤维素是植物细胞壁的主要成分，然而除了纤维素以外，植物纤维素还有其他的包括多糖等聚合物，如半纤维素、木质素及果胶等，这些杂质使得植物纤维素的纯度不高，需要经过复杂的后处理过程才能得到纯度较高的纤维素。 与植物纤维素相比，由于BC是某些微生物分泌到细胞外的产物，不存在半纤维素、木质素等其他杂质[7]。因此，BC的纯度很高，是一种“纯纤维素”。在经过热碱处理和纯水反复冲洗等简单的后处理过程后，BC中残留的培养基、细菌菌体等物质能够被去除，从而得到化学纯度极高、结构均一的纤维素，纯化产物中的纤维素含量可达到95%以上[8， 9]。重要的是，通过这种简单方式不仅可得到化学纯度极高的纤维素，而且还不会改变纤维素的化学结构。 因此，与植物纤维素相比，BC的优势在于其化学纯度极高，收获纤维素的后处理过程简单易行。 2.细菌纤维素的聚合度 与小分子化合物不同，纤维素是一种天然的高分子，其分子量具有以下两个特征：一是纤维素具有远大于小分子化合物的分子量，二是纤维素的分子量具有多分散性的特点。因此，纤维素的分子量常用聚合度（degree of polymerization，DP）来表示，即其分子量为162×DP，利用高效凝胶渗透色谱可以测定纤维素的重均分子量分布及数均分子量分布。 由于细菌的种类和发酵条件的不同，BC的聚合度也会有所差异。基于菌种的差异，BC的聚合度在2000～6000之间[10]，但是在某些情况下，其聚合度甚至可以达到16000～20000。一般而言，木葡糖醋杆菌生产的BC聚合度在16000左右。相比之下，由于木质素、半纤维素和果胶等杂质的存在，优质棉纤维的聚合度*高只能达到13000～14000，而木浆纤维素为7000～10000，短绒棉仅为5000左右[11]。由此可知，木葡糖醋杆菌合成BC的聚合度优于木浆和棉等植物纤维素。 3.细菌纤维素的结晶度 作为一种天然高分子，BC的结构重复单元拥有大量羟基。羟基上极性极强的氢原子会与另一个羟基上强电负性的氧原子上的孤对电子相互吸引，从而在纤维素高分子链内和高分子链间形成氢键，使得BC形成各种长度和形态不同的结晶。根据葡聚糖链的聚集形态不同，可形成晶体或非晶体，因此纤维素中存在非晶区和结晶区两种结构。一般而言，有序的结晶区结构分布于纤维素的中部，分子排列规整；在结晶区外围的长带区域为非晶区，具有松弛、分子链排列结构不整齐、无序等特点，分子链取向大致与纤维素的主轴平行。纤维素中的结晶区与非晶区无固定的界线，呈现逐渐过渡状态[12]。BC的非晶区和结晶区示意如图1-2所示[13]。 图1-2 BC的非晶区和结晶区[13] 纤维素的结晶度是指纤维素的结晶区占纤维素整体的百分数，反映了纤维素聚集时形成晶体的程度，计算方法见式（1-1）。 （1-1） 采用拉曼光谱、X射线衍射、红外光谱（FTIR）以及固体核磁共振（CP/MAS 13 C NMR）对纤维素结晶的晶体类型进行分析，发现纤维素由纤维素Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型这4种结晶类型构成。其中，纤维素Ⅰ型和纤维素Ⅱ型为两种常见的结晶形式。在已知的天然纤维素中，大多数植物和静态培养细菌所合成的纤维素Ⅰ型以平行的β-1， 4-葡聚糖链呈单轴排列，而纤维素Ⅱ型的β-1， 4-葡聚糖链则以随机方式排列。纤维素Ⅰ型又存在 和 两种晶体结构：纤维素 是以纤维二糖为单元形成三斜晶系的P1结构；而纤维素 则是以两个纤维二糖为单元形成单斜晶系的P21结构。纤维素Ⅱ型由纤维素Ⅰ型经过溶解再生或者丝光处理得到，大多为反向平行排列并与更多数量的氢键连接，这使得纤维素Ⅱ型具有更高的热力学稳定性。结晶结构的不同会影响纤维素的力学性能，单根纤维力学性能测试发现，纤维素Ⅰ型的杨氏模量能达到27 GPa，而转变到纤维素Ⅱ型时，杨氏模量则会下降为21 GPa[14]。 在自然界中，细菌和海藻所生产的纤维素富含的纤维素类型为 ，且比例高达70%～80%[15]；而高等植物和被囊类动物所合成的纤维素多以 为主，所占比例与BC类似。较之于高等植物纤维素，由于BC在合成过程中无木质素、半纤维素等杂质，所以BC除了拥有极高的化学纯度外，还具有高达95%的结晶度[16]。 BC的结晶组成可根据培养基条件调整，这是由于培养基的pH、反应器的类型、培养基的组分或者细菌菌株，均能对纤维素的结晶产生影响。Watanabe等[17]研究了发酵方式对BC结晶的影响，结果显示，动态发酵的BC（A-BC）比静态发酵的BC（S-BC）的结晶度更低，微晶尺寸更小，并且在动态发酵培养基中发现BC具有显著的纤维素Ⅱ型结晶。张少瑞[18]利用果糖和葡萄糖对不同菌种生产的BC进行了研究，发现不同类型的木葡糖醋杆菌所产生纤维素的结晶度高低基本不受两种碳源类型和浓度的影响。 4.细菌纤维素的反应性 BC是一种分子量大、结构复杂的天然高分子化合物，其性质取决于BC分子链中的苷键以及葡萄糖基上的三个羟基，由于C2、C3和C6位羟基的性质差异，具体表现为多元醇性质。 纤维素的反应性是指纤维素大分子结构中的伯羟基及仲羟基的反应能力。纤维素每个吡喃葡萄糖环上的三个活泼羟基均能发生一系列与羟基相关的化学反应，如酯化、氨基化、氧化、接枝共聚、硅烷化以及交联等，不同位置的羟基所发生的反应以及反应活性均有所差异。 由于生产BC菌种的不同和发酵条件的差异，所形成的BC也存在多种不同的形态结构，这些差异会影响纤维素的反应性和*终产物的均一性，具体影响因素有BC的形态结构差异、BC的超分子结构差异、BC的聚合度及其分布等。 5.细菌纤维素的反应特点 与植物纤维素类似，BC的化学反应体系根据反应相态的区别可分为多相反应和均相反应两种类型。两种类型的反应能力以及反应试剂抵达纤维素羟基的难易程度也有所差异，该性质被称为纤维素的可及度。 与植物纤维素相同，BC具有难溶性和高结晶性的特点，这导致BC的很多化学反应必须在多相介质中进行，这种反应类型被称为多相反应。一般认为，大多数的反应试剂仅能穿透至纤维素的非晶区进行反应，而不能进入紧密堆砌的结晶区[19]。 在多相反应中，固态的BC悬浮于液态反应介质中，纤维素分子内和分子间存在强烈的氢键作用，而且特定部位的纤维素也具有不同的形态，这使得多相反应仅能在纤维素的表面进行，并且仅当纤维素表面被充分反应后，纤维素的次外层才能与化学试剂接触。因此，BC的多相反应是一个由外至内的逐层反应过程，对于BC的结晶区而言，反应则存在更大的难度。 纤维素的多相反应受到纤维素的表面以及非晶区的限制，所以BC多相反应的取代并不均匀，导致副产物较多且产率较低。纤维素的多相反应示意如图1-3所示。 图1-3 纤维素的多相反应 BC的均相反应是指整体纤维素分子完全溶解于溶剂中，在此条件下，纤维素分子内和分子间氢键均解离，此时BC分子链中伯、仲羟基较容易与反应试剂进行反应[20]。 因此，纤维素的均相反应不存在反应试剂逐层渗入纤维素的速率问题，这使得纤维素的反应性能被极大地提高，反应速率高于多相反应，且所得产物的取代基分布也会更加均匀。纤维素的均相反应示意如图1-4所示。 图1-4 纤维素的均相反应 1.2 细菌纤维素的物理结构和性质 1.2.1 细菌纤维素的物理结构 虽然BC的化学结构与植物纤维素相同，其分子内与分子间存在大量的氢键并形成网状结构，但是其大分子结构与物理性能却与植物纤维素大相径庭。